C1 · 环境条件强制采样环境条件 · 关闭门窗时间、系统运转状态
15 ~ 30 min采样时集中空调通风系统应正常运转且关闭门窗15 min~30 min以上,尽量减少人员活动幅度与频率,记录室内人员数量、温湿度与天气状况等出处:5C1 · 环境条件强制集中空调通风系统 · 检测运行状态
应在集中空调通风系统正常运转条件下进行检测检测时出处:45C2 · 试验介质/溶液纯水 · 水质等级
纯水 1 000 mL(水质符合 GB/T 6682 中三级水或以上的要求)培养基配制用纯水出处:11C2 · 试验介质/溶液ACES 缓冲液 · pH
6.8±0.2 pH用 0.1 mol/L KOH 或 0.1 mol/L H2SO4 调节出处:11C2 · 试验介质/溶液培养基 · 最终 pH
6.8±0.2 pH室温为 25 ℃ 时出处:11C2 · 试验介质/溶液硫酸多黏菌素 B 溶液 · 浓度
14545±None IU/mL取适量硫酸多黏菌素 B(一般为 200 mg) 溶解于 100 mL 水中出处:11C2 · 试验介质/溶液强制尿素生化反应管培养基 · 尿素最终浓度
2±None %尿素生化反应管出处:11C2 · 试验介质/溶液强制尿素生化反应管培养基 · 最终 pH
7.2±0.1 pH尿素生化反应管出处:11C2 · 试验介质/溶液强制明胶生化反应管培养基 · 最终 pH
6.9±0.1 pH明胶生化反应管出处:11C2 · 试验介质/溶液盐酸-氯化钾溶液 · 最终 pH
2.2±0.2 pH用 1 mol/L 氢氧化钾调节出处:11C2 · 试验介质/溶液血琼脂培养基 · pH
7.5±0.1将蛋白胨、氯化钠、琼脂加热溶化于纯水中出处:6.7.2.2C2 · 试验介质/溶液3%过氧化氢溶液 · 配制比例
吸取 100 mL 30% 过氧化氢溶液, 溶于 900 mL 纯水中3%过氧化氢溶液配制出处:45C3 · 样品状态调节允许样品 · 离心条件
如有杂质可静置沉淀或 1 000 r/min 离心 1 min 去除如有杂质可静置沉淀或 1 000 r/min 离心 1 min 去除出处:11C3 · 样品状态调节样品 · 过滤膜孔径
0.45±None μm将经沉淀或离心的样品通过滤膜过滤器进行过滤出处:11C3 · 样品状态调节样品洗脱液 · 热处理温度
50±1 ℃取 1 mL 洗脱液,置于恒温水浴箱中加热 30 min出处:11C3 · 样品状态调节样品洗脱液 · 酸处理放置时间
5±None min取 1 mL 洗脱液,加入 1 mL 酸缓冲液,轻轻摇匀,室温放置出处:11C3 · 样品状态调节采样材料 · 干燥与冷却条件
将采样材料放在 105℃ 恒温箱内,干燥 2 h 后放入干燥器内冷却 4 h称量初质量前出处:45C4 · 样品采集/保存L-半胱氨酸盐酸盐和焦磷酸铁溶液 · 保存时间
≤ 3 月于 -20 ℃ 保存出处:11C4 · 样品采集/保存硫酸多黏菌素 B 溶液 · 保存温度
-25 ~ -15 ℃用无菌管分装,每管 5.5 mL出处:11C4 · 样品采集/保存万古霉素溶液 · 保存温度
-25 ~ -15 ℃每管 1 mL出处:11C4 · 样品采集/保存放线菌酮溶液 · 保存温度
-25 ~ -15 ℃用无菌管分装,每管 4 mL出处:11C4 · 样品采集/保存马尿酸盐生化反应管 · 保存温度
-20±None ℃无菌分装,每管 0.4 mL出处:11C4 · 样品采集/保存盐酸-氯化钾溶液 · 保存时间
≤ 1 月置于加塞的玻璃瓶中,室温下避光放置出处:11C4 · 样品采集/保存采样瓶 · 硫代硫酸钠溶液加入量
0.3 ~ 0.5 mL每瓶中加入硫代硫酸钠溶液 [c(Na2S2O3)=0.1 mol/L],中和样品中的氧化剂出处:11C4 · 样品采集/保存水样 · 采样体积
500±None mL每个采样点依无菌操作出处:11C4 · 样品采集/保存强制水样 · 贮存时间
≤ 15 d如当天不能进行检测,室温下避光贮存出处:11C4 · 样品采集/保存微生物气溶胶采样器 · 采样吸收液体积
20±None mL将采样吸收液倒入微生物气溶胶采样器中出处:11C4 · 样品采集/保存微生物气溶胶采样器 · 矿物油加入量
1 ~ 2 滴用无菌吸管加入出处:11C4 · 样品采集/保存强制气溶胶样品 · 送检时间
≤ 4 h采集的样品不应冷冻,但应避光和防止受热出处:11C4 · 样品采集/保存强制采样过程 · 无菌操作要求
整个采样过程应无菌操作。整个采样过程应无菌操作出处:5C4 · 样品采集/保存强制试剂材料与操作 · 无菌状态与无菌操作
在采样开始前,确保所用试剂和材料为无菌状态,操作过程和样品运输中应无菌操作,避免人为污染。在采样开始前,确保所用试剂和材料为无菌状态,操作过程和样品运输中应无菌操作,避免人为污染出处:5.8.2C5 · 设备能力要求电子天平 · 精度
≤ 0.001 g电子天平出处:11C5 · 设备能力要求离心机 · 转速
≥ 12000 r/min离心机出处:11C5 · 设备能力要求微生物气溶胶采样器 · 采样流量
≥ 100 L/min微生物气溶胶采样器出处:11C5 · 设备能力要求液体冲击式微生物气溶胶采样器 · 采样流量
7 ~ 15 L/min液体冲击式微生物气溶胶采样器出处:11C5 · 设备能力要求精密 pH 试纸或电位 pH 计 · 测量范围
0 ~ 14.0 pH精密 pH 试纸或电位 pH 计出处:11C5 · 设备能力要求离心机 · 转速
12000±None r/min离心机设备能力要求出处:4.1.8.3C5 · 设备能力要求电子天平 · 精度
0.0001±None g电子天平精度要求出处:5C5 · 设备能力要求定量采样机器人或采样规格板 · 采样面积与采样精度
≤ 20 %采样机器人采样面积为50 cm²或100 cm²,采样精度为与标准方法的相对误差小于20%,采样规格板面积为25 cm²出处:5C5 · 设备能力要求强制采样器 · 流量校准相对偏差
≤ 5 %采样器需定期在负载条件下用检定合格的流量计进行校准,相对偏差不应超过5%出处:5.8.1C5 · 设备能力要求强制采样系统 · 气密性检查
在采样前应对采样系统的气密性进行检查,不应漏气;在采样前应对采样系统的气密性进行检查,不应漏气出处:5.8.2C5 · 设备能力要求校正粒子 · 几何标准偏差
≤ 1.25校正粒子为平均粒径0.6μm的聚苯乙烯粒子出处:45C5 · 设备能力要求允许光散射式粉尘仪 · PM10质量浓度测量范围
≥ 0.001 mg/m3使用光散射式粉尘仪进行测量出处:45C5 · 设备能力要求采样规格板 · 面积误差
≤ 5 %手工擦拭采样规格板面积为50cm2或100cm2出处:45C5 · 设备能力要求标准皮托管 · 系数
0.99±0.01标准皮托管出处:45C5 · 设备能力要求倾斜式微压计或数字式微压计 · 最小读数
≤ 1 Pa倾斜式微压计或数字式微压计出处:45C5 · 设备能力要求标准粒子发生器 · 颗粒物粒径范围
0.5 ~ 8 μm标准粒子发生器出处:45C5 · 设备能力要求标准粒子发生器 · 粒径几何标准差
≤ 1.1 μm标准粒子发生器出处:45C5 · 设备能力要求标准粒子发生器 · 颗粒物浓度范围
0.5 ~ 1.5 mg/m3标准粒子发生器出处:45C5 · 设备能力要求标准粒子发生器 · 浓度稳定性
浓度稳定性 ± 10%标准粒子发生器出处:45C5 · 设备能力要求强制光散射粉尘仪 · 型号和性能一致性
两台仪器的型号和性能应相同使用两台光散射粉尘仪测定浓度时出处:45C6 · 精密度/质控限强制阳性对照 · 阳性对照菌株设置
应设置阳性对照(嗜肺军团菌标准菌株 ATCC 33152 或其他等效标准菌株)。应设置阳性对照(嗜肺军团菌标准菌株ATCC 33152或其他等效标准菌株)出处:4.1.8.1C6 · 精密度/质控限阳性对照 · 阳性对照Ct值
≤ 36阳性对照Ct值≤36且有明显指数增长出处:5C6 · 精密度/质控限阴性对照 · 阴性对照Ct值
≥ 39阴性对照Ct值>39或无Ct值,线形为直线或轻微斜线,无明显指数增长期和平台期出处:5C6 · 精密度/质控限空白对照 · 空白对照设置
同时分别取 1 mL Tween-80 水溶液加入两个无菌平皿作空白对照。同时分别取1 mL Tween-80水溶液加入两个无菌平皿作空白对照出处:80C6 · 精密度/质控限强制培养基无菌检查 · 无菌检查抽样数与结果要求
每批培养基配制后需做无菌检查,可每批选定3个培养基培养观察,结果应无菌落生长。每批培养基配制后需做无菌检查,可每批选定3个培养基培养观察,结果应无菌落生长出处:5.7.2.2C6 · 精密度/质控限强制现场空白对照 · 空白对照设置与结果要求
应同时进行现场空白对照试验,每次或每个区域取一个对照培养基,与采样培养基同法操作但不需暴露采样,然后与采样后的培养基一起放入培养箱培养,结果应无菌落生长。为避免运输和保存过程中的污染,应同时进行现场空白对照试验,每次或每个区域取一个对照培养基,与采样培养基同法操作但不需暴露采样,然后与采样后的培养基一起放入培养箱培养,结果应无菌落生长出处:5.8.3C6 · 精密度/质控限空白对照不合格处理 · 批次作废与重新采样
如空白对照有菌生长,则本批次样品作废,需重新采样检测。如空白对照有菌生长,则本批次样品作废,需重新采样检测出处:5.8.4C6 · 精密度/质控限强制β-溶血性链球菌试验 · 对照设置
试验应设置阳性对照和阴性对照试验过程出处:45C6 · 精密度/质控限光散射式粉尘仪 · 测量相对误差
≤ 10 %对于校正粒子出处:45C6 · 精密度/质控限强制阴性对照 · 无菌生长
阴性对照组应无菌生长。阴性对照组出处:45C7 · 分级/条件限值推荐GVPC平板菌落计数 · 菌落数触发稀释复检
≥ 300 CFUGVPC平板上菌落数大于300 CFU时,洗脱液稀释10倍后重复f)操作出处:11C7 · 分级/条件限值PCR检测结果判定 · 阳性判定Ct值
≤ 36样本检测结果Ct值≤36且有明显指数增长判定为阳性出处:5C7 · 分级/条件限值允许PCR检测结果判定 · 可疑判定Ct值范围
36 ~ 39样本检测结果Ct值在36~39判定为可疑出处:5C7 · 分级/条件限值强制PCR可疑结果复检 · 重复检测Ct值范围
36 ~ 39Ct值在36~39时应对样本重复检测,如重复实验结果Ct值仍在36~39且有明显指数增长则判定为阳性,否则为阴性出处:5C7 · 分级/条件限值PCR检测结果判定 · 阴性判定Ct值
≥ 39样本检测结果Ct值>39或无Ct值判定为阴性出处:5C7 · 分级/条件限值强制PCR初筛阳性样品 · 最终判定方法
当冷却水、冷凝水或送风样品嗜肺军团菌经 PCR 检测方法初筛阳性时,应按培养法进行培养鉴定并以培养法结果作为最终判定结果。冷却水、冷凝水或送风样品嗜肺军团菌经PCR检测方法初筛阳性时出处:5C7 · 分级/条件限值允许风管采样点设置 · 送风口抽样比例与最少采样点数
3 ~ 5 %如确实无法在风管中采样,可抽取该套系统全部送风口的3%~5%,且不少于3个作为采样点出处:5C8 · 适用范围与限制检测报告 · 未检出结果表述与样品体积注明
在检测报告中注明“未检出嗜肺军团菌”,并注明检测水样或空气样品体积。冷却水、冷凝水或空气样品中未见嗜肺军团菌可疑菌落生长时出处:11C8 · 适用范围与限制强制商品化PCR试剂盒 · 操作与结果判定依据
如果使用商品化 PCR 试剂盒,应按照试剂盒说明书进行操作和结果判定。使用商品化PCR试剂盒时出处:5C8 · 适用范围与限制强制细菌总数结果 · 结果修约
计算得出的细菌总数的值应四舍五入到整数。计算得出的细菌总数的值应四舍五入到整数出处:80C8 · 适用范围与限制允许细菌总数结果报告 · 结果表示方式
菌落数小于 100 CFU 时,以整数报告,菌落数大于 100 CFU 时,可用保留 2 位有效数字的 10 的指数形式来表示。菌落数小于100 CFU时以整数报告,菌落数大于100 CFU时可用保留2位有效数字的10的指数形式表示出处:5.7.1.2C8 · 适用范围与限制细菌总数结果报告 · 未检出结果表述
若所有培养基均无菌落形成,则以“未检出”报告。若所有培养基均无菌落形成,则以“未检出”报告出处:5.7.1.2C8 · 适用范围与限制强制真菌总数测定结果 · 结果修约
计算得出的真菌总数的值应四舍五入到整数。计算得出的真菌总数出处:6.5.2.2C8 · 适用范围与限制强制β-溶血性链球菌测定结果 · 结果修约
计算得出的 β-溶血性链球菌的值应四舍五入到整数。计算得出的β-溶血性链球菌的值出处:45C9 · 过程控制参数ACES 溶液 · 水浴溶解温度
45 ~ 50 ℃ACES 颗粒加入纯水中溶解出处:11C9 · 过程控制参数培养基 · 高压蒸汽灭菌
加入琼脂混合均匀后于 121 ℃ 高压蒸汽灭菌 15 min加入琼脂混合均匀后出处:11C9 · 过程控制参数灭菌后培养基 · 冷却温度
50±None ℃灭菌后用冷水浴冷却出处:11C9 · 过程控制参数培养基 · 每皿倾注量
20±None mL直径为 90 mm 的平皿出处:11C9 · 过程控制参数尿素生化反应管培养基 · 高压灭菌
于 121^{\circ}C ± 1^{\circ}C 高压灭菌 15 min加入琼脂,加热溶化并分装烧瓶出处:11C9 · 过程控制参数样品洗脱液 · 接种量
0.2±None mL取洗脱液、热处理洗脱液及酸处理洗脱液分别接种 GVPC 琼脂平板各一个出处:11C9 · 过程控制参数接种平板 · 培养条件
将接种平板倒置在温度为 36^{\circ}C ± 1^{\circ}C , CO_{2} 浓度(体积分数)为 5% 培养箱中, 培养 10 d将接种平板倒置在培养箱中出处:11C9 · 过程控制参数强制平板 · 紫外灯暴露时间
≤ 10 s为了避免嗜肺军团菌的死亡,不应将平板长时间暴露在紫外灯下出处:11C9 · 过程控制参数可疑菌落初筛培养 · CO2浓度、培养温度、培养时间
5±None %从GVPC培养基选择3d~10d内生长的可疑菌落接种于BCYE和BCYE-Cys平板出处:11C9 · 过程控制参数吸收液热处理 · 水浴温度与加热时间
50±1 ℃取1 mL吸收液置恒温水浴箱中加热30 min出处:11C9 · 过程控制参数吸收液酸处理 · 室温放置时间
5±None min取1 mL吸收液加入1 mL酸缓冲液轻轻摇匀后室温放置出处:11C9 · 过程控制参数吸收液接种 · 接种体积
0.2±None mL吸收液、热处理吸收液及酸处理吸收液分别接种GVPC琼脂平板出处:11C9 · 过程控制参数DNA提取离心与煮沸 · 离心转速、离心时间、水浴温度与时间
12000±None r/min吸取洗脱液或吸收液1 mL加入1.5 mL无菌离心管,离心5 min后弃上清液,保留沉淀,加入DNA提取液50 μL悬浮后100 ℃水浴煮沸5 min,再12000 r/min离心2 min出处:4.1.8.3C9 · 过程控制参数可疑菌落DNA提取 · 水浴温度与时间、离心转速与时间
100±None ℃用接种环挑取单个可疑菌落于DNA提取液50 μL中振荡混匀,100 ℃水浴煮沸5 min,12000 r/min离心2 min出处:4.1.8.3C9 · 过程控制参数荧光PCR扩增体系 · 反应体系各组分体积
25±None μL荧光PCR扩增体系(25 μL):PCR反应体系10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1.25 μL,探针(10 μmol/L)0.625 μL,模板5 μL,无核酸酶去离子水补足至25 μL出处:4.1.8.3C9 · 过程控制参数荧光PCR扩增条件 · UNG酶处理温度与时间、预变性温度与时间
50±None ℃50 ℃尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)处理2 min,95 ℃预变性3 min出处:4.1.8.3C9 · 过程控制参数荧光PCR扩增循环 · 退火延伸温度与时间、循环数
55±None ℃55 ℃退火延伸60 s,检测荧光信号,进行40个循环出处:4.1.8.3C9 · 过程控制参数培养基制备 · pH、灭菌温度与时间、倾注温度与体积
7.4±0.2将蛋白胨、氯化钠、牛肉浸膏加热溶于纯水中,调节pH为7.4±0.2,加入琼脂,121 ℃、15 min灭菌后,待冷却至50 ℃左右,以无菌操作每皿倾注15 mL培养基于直径90 mm平皿中备用出处:5C9 · 过程控制参数空气微生物采样 · 采样流量与采样时间
28.3±None L/min以无菌操作,使用六级筛孔撞击式微生物采样器以28.3 L/min流量采集5 min出处:5C9 · 过程控制参数营养琼脂平皿培养 · 培养温度与培养时间
36±1 ℃将采样后的营养琼脂平皿倒置于培养箱中培养48 h±2 h,观察计数结果出处:5C9 · 过程控制参数积尘样品处理 · 称样量与Tween-80水溶液体积及浓度
1.0±None g无菌操作,称取刮拭法或擦拭法采集的积尘样品1.000 g,加入10 mL吐温-80(ψ=0.01%)水溶液出处:5C9 · 过程控制参数梯度稀释操作 · 吸管或吸头更换频次
每递增稀释一次,换用 1 次 1 mL 无菌吸管或吸头。每递增稀释一次,换用1次1 mL无菌吸管或吸头出处:80C9 · 过程控制参数稀释度接种 · 接种体积与平皿数
1±None mL在梯度稀释的同时,选择适宜稀释度,每个稀释度取1 mL分别接种两个无菌平皿出处:80C9 · 过程控制参数强制细菌总数结果计算 · 平行平皿平均值与稀释倍数
每个稀释度的菌落数应采用两个平行无菌平皿的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为细菌总数检测结果。每个稀释度的菌落数应采用两个平行无菌平皿的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为细菌总数检测结果出处:5.7.1.3C9 · 过程控制参数强制真菌总数测定结果 · 平行平皿数及计算方式
每个稀释度的菌落数应采用两个平行无菌平皿的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数每个稀释度的菌落数出处:6.7.1.3C9 · 过程控制参数血琼脂培养基 · 灭菌条件
121℃, 15 min 灭菌血琼脂培养基制备出处:6.7.2.2C9 · 过程控制参数血琼脂平板 · 倾注体积
15±None mL45 ℃左右以无菌操作加入无菌脱纤维羊血后出处:6.7.2.2C9 · 过程控制参数革兰氏染色 · 染色时间
染1 min,水洗,滴加革兰氏碘液,作用1 min,水洗革兰氏染色操作出处:45C9 · 过程控制参数革兰氏染色 · 脱色时间
15 ~ 30 s滴加95%(体积分数)乙醇脱色出处:45C9 · 过程控制参数培养基 · 培养温度与时间
在 36℃ ± 1℃ 恒温培养箱中培养 18h ~ 24h采样后的培养基倒置培养出处:45C9 · 过程控制参数标准粒子发生器 · 发生粒子浓度
3 ~ 10 倍实验室测定时在0.5μm~8μm范围内发生5种代表性粒径的单分散相标准粒子出处:45C9 · 过程控制参数六级筛孔撞击式微生物采样器 · 采样流量与时间
流量为 28.3 L/min,采样时间为 5 min待空气净化消毒装置运行稳定后同时采集入口和出口空气出处:45C9 · 过程控制参数培养基 · 培养温度与时间
培养温度 36℃ ± 1℃ ,48 h 记录结果采样结束后将培养基放入培养箱中培养出处:45