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检测方法 AI 结构化解析
GB/T5750.12-2023　生活饮用水标准检验方法 第 12 部分: 微生物指标 Standard examination methods for drinking water—Part 12: Microbiological indices
发布日期 2023-03-17
实施日期 2023-10-01
替代标准 GB/T 5750.12—2006
解析引擎 v3.4
适用范围 本文件描述了生活饮用水和水源水中菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、贾第鞭毛虫、隐孢子虫、肠球菌和产气荚膜梭状芽孢杆菌的测定方法。本文件适用于生活饮用水和水源水中微生物指标的测定。
10 参数限值 29 试验方法 12 计算公式 9 术语 331 约束 3 引用 来源：国家标准全文公开系统
解析版本
AI 问答 术语 限值速查 限值判定 试验方法 计算公式 约束条件 引用标准 能力表述 质检复核
菌落总数3.1
在一定条件下,经一定时间培养后所得 1 mL 水样中的微生物菌落个数。
总大肠菌群3.2
一群在 37°C 培养，24 h 内能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
耐热大肠菌群3.3
一群在 44.5°C 培养，24 h 内能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
大肠埃希氏菌3.4
一群能发酵多种糖类、产酸产气、周身鞭毛、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌，通常存在于人和温血动物的肠道以及粪便中。
贾第鞭毛虫3.5
一种可在水中或其他介质中发现的原虫类寄生虫，可感染人类致病。注：贾第鞭毛虫孢囊呈椭圆形，长度为 8 μm～14 μm，宽度为 7 μm～10 μm，孢囊形成初期内部有 2 个细胞核，成熟后增加至 4 个细胞核。
隐孢子虫3.6
一种可在水中或其他介质中发现的原虫类寄生虫，可感染人类致病。注：隐孢子虫卵囊为稍微椭圆的圆形，直径 4 μm～8 μm，成熟卵囊内部有 4 个细胞核。
肠球菌3.7
一类成双或呈链状排列、兼性厌氧、无芽孢和荚膜的革兰氏阳性球菌，属 D 族链球菌，通常存在于人和温血动物的肠道以及粪便中。
产气荚膜梭状芽孢杆菌3.8
一类能还原亚硫酸盐，具有芽孢的革兰氏阳性厌氧杆菌，通常存在于人和温血动物的肠道以及粪便中。
最可能数3.9
基于泊松分布,利用统计学原理,根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数,估算一定体积样品中目标微生物存在的数量,即单位体积存在目标微生物的最大可能数。
菌落总数
水样—MPN/mL4.2.5.1
总大肠菌群
水样—MPN/100 mL5.1.5
总大肠菌群菌落数
5.2 滤膜法 · 水样—CFU/100 mL5.2.5.3
总大肠菌群
5.3 酶底物法 · 水样—MPN/100 mL5.3.5.3.2
总大肠菌群
51孔定量盘法 · 水样—MPN/100 mL5.3.5.4
耐热大肠菌群
多管发酵法 · 水样—MPN/100 mL6.1
耐热大肠菌群
滤膜法 · 生活饮用水及低浊度水源水—CFU/100 mL6.2
大肠埃希氏菌
多管发酵法 · 水样—MPN/100 mL7.1
贾第鞭毛虫孢囊
水—个/10 L8.1.4.4
隐孢子虫卵囊
水—个/10 L8.1.4.4
检测结果限值判定（演示）
检测项目
测定结果
判定逻辑：测定结果与限值直接比对（未含测量不确定度保护带），正式报告请按 ILAC-G8 / 标准原文复核。
就这本标准问我
回答基于本标准的结构化解析与条款文本检索生成，附条款溯源；AI 解读请以标准正式原文为准。
看完方法，直接落成原始记录：自动带出检测要求与质控核查项，录读数自动计算判定，可导出活公式 Excel
平皿计数法4.1
1 mL 水样在营养琼脂培养基上、在有氧条件下 36℃±1℃ 培养 48 h 后，所得 1 mL 水样中的菌落总数的方法。
仪器 8 项试剂 5 项步骤 5 步
仪器设备
高压蒸汽灭菌器培养箱（36℃±1℃）电炉电子天平冰箱放大镜或菌落计数器pH 计或精密 pH 试纸无菌试管、平皿(直径为9 cm)、无菌吸管或移液器、采样瓶等（平皿直径9 cm）
试剂材料
蛋白胨（10.0 g）牛肉膏（3.0 g）氯化钠（5.0 g）琼脂（10.0 g~20.0 g）纯水（1000 mL）
分析步骤
1以无菌操作方法用无菌吸管或移液器吸取 1 mL 充分混匀的水样，注入无菌平皿中，倾注约 15 mL 已融化并冷却到 45 ℃ 左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。
2待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于 36℃±1℃ 培养箱内培养 48 h±2 h，进行菌落计数，即为 1 mL 水样中的菌落总数。
3水源水：以无菌操作方法用无菌吸管或移液器吸取 1 mL 充分混匀的水样，注入盛有 9 mL 无菌生理盐水的试管中，混匀成 1:10 稀释液。
4用无菌吸管或移液器吸取 1:10 的稀释液 1 mL 注入盛有 9 mL 无菌生理盐水的试管中，混匀成 1:100 稀释液。按同法依次稀释成 1:1000、1:10000 等稀释度的液体备用。每稀释一个稀释度，应更换一次 1 mL 无菌吸管或吸头。
5用无菌吸管或移液器吸取 2 个～3 个适宜稀释度的水样 1 mL，分别注入无菌平皿内。以下操作同生活饮用水的检验步骤。
酶底物法4.2
利用复合酶技术，在培养基中加入多种独特的酶底物，每一种酶底物都针对不同的细菌酶设计，且包含最常见的介水传播的细菌，所有的酶底物在被分解时均产生相同的信号。水样检测过程中，水样中存在的细菌分解一种或者多种酶底物，之后产生一个相同的信号，在检测菌落总数时，这个信号即为在波长 366nm 紫外灯下所产生的荧光。使用基于复合酶底物技术(Multiple Enzyme Technology)的培养基，其中酶底物被微生物的酶水解，在 36℃±1℃ 下培养 48h 后能够最大限度地释放4-甲基伞形酮，4-甲基伞形酮在 366nm 紫外灯照射下发出蓝色荧光，对呈现蓝色荧光的培养盘孔槽计数并查阅MPN表，可以确
仪器 0 项试剂 1 项步骤 0 步
试剂材料
复合酶底物培养基
4-甲基伞形酮磷酸酯荧光法（培养盘定量法）4.2.4
仪器 11 项试剂 9 项步骤 4 步
仪器设备
采样容器（100 mL 无菌玻璃瓶、无菌塑料瓶或无菌塑料袋）电子天平滤膜（孔径 0.22 μm）高压蒸汽灭菌器无菌吸管（1 mL、5 mL 及 10 mL）移液器试管（约 15 mm × 160 mm）涡旋混合器培养盘（定量培养用无菌塑料盘，含有 84 个孔槽，每个孔槽容纳 0.06 mL 待测水样）培养箱（36 ℃ ± 1 ℃）紫外灯（波长 366 nm）
试剂材料
葡萄糖（1.25 g）无水硫酸镁（0.2 g）蛋白胨（5.0 g）酵母提取物（3.5 g）4-甲基伞形酮磷酸酯（0.0375 g）4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷（0.03 g）纯水（1000 mL）氯化钠（8.5 g）纯水（1000 mL）
分析步骤
1向一无菌试管中加入 9 mL 制备好的液体培养基；如选用符合要求的成品培养基，则向装有 0.1 g 培养基的试管中加入 9 mL 无菌生理盐水。取 1 mL 水样加入上述试管中，涡旋振荡混匀。
2将混匀后的水样倒入培养盘中心位置，将培养盘盖好，放置在水平桌面上，紧贴桌面顺时针轻柔晃动培养盘，将待测水样分配到培养盘的所有孔槽中。
3将培养盘 90°～120° 竖起，使多余的水样由盘内海绵条吸收，将培养盘缓慢翻转过来，倒置放于 36 ℃ ± 1 ℃ 培养箱中，培养 48 h。可叠放培养，不宜超过 10 层。
4将培养后的培养盘取出，倒置于暗处或紫外灯箱内，在 6 W 366 nm 紫外灯下约 13 cm 处观察，记录产生蓝色荧光的孔数。如未放置在紫外灯箱内，观察时需佩戴防紫外线的护目镜。培养盘中的 84 个孔，无论荧光强弱，只要呈现蓝色荧光即为阳性，但海绵条的荧光不计入结果。
多管发酵法5.1
经36℃±1℃培养24h，发酵乳糖产酸产气、经证实试验和革兰氏染色检测水中总大肠菌群的方法。
仪器 10 项试剂 7 项步骤 5 步
仪器设备
培养箱（36℃±1℃）冰箱电子天平显微镜平皿（直径9cm）试管无菌吸管（1mL、10mL）锥形瓶小倒管载玻片
试剂材料
乳糖蛋白胨培养液二倍浓缩乳糖蛋白胨培养液伊红美蓝培养基结晶紫染色液革兰氏碘液脱色剂（乙醇[φ(C2H5OH)=95%]）沙黄复染液
分析步骤
1乳糖发酵试验：用无菌吸管或移液器吸取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，取1mL水样接种到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1mL水样注入到9mL无菌生理盐水中，混匀后取1mL（即0.1mL水样）注入到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管；对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接接种5份10mL水样双料培养基，每份接种10mL水样。
2检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1mL、0.1mL、0.01mL，甚至0.1mL、0.01mL、0.001mL，每个稀释度接种5管单料乳糖蛋白胨培养液，每个水样共接种15管。接种1mL以下水样时，应作10倍递增稀释后，取1mL接种，每递增稀释一次，换用1支1mL无菌吸管。
3将接种管置于36℃±1℃培养箱内，培养24h±2h，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产气产酸，则可报告为总大肠菌群未检出，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。
4分离培养：将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36℃±1℃培养箱内培养18h～24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落进行革兰氏染色镜检：——深紫黑色、具有金属光泽的菌落；——紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；——淡紫红色、中心较深的菌落。
5证实试验：经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36℃±1℃培养箱中培养24h±2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。
5.2 滤膜法5.2
用孔径为0.45 μm的微孔滤膜过滤水样后，将滤膜贴在选择性培养基上培养后，能形成典型菌落，经革兰氏染色和证实试验，来检测水中总大肠菌群的方法。
仪器 3 项试剂 2 项步骤 5 步
仪器设备
过滤设备（配备滤器和抽滤装置）滤膜（孔径0.45 μm）无齿镊子
试剂材料
品红亚硫酸钠培养基乳糖蛋白胨培养液
分析步骤
1用镊子夹取无菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将100 mL水样注入滤器中，打开滤器阀门，在-5.07×10^4 Pa（-0.5大气压）下抽滤。
2过滤完水样后，再抽气约5 s，关上滤器阀门，取下滤器，用镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不应留有气泡，然后将平皿倒置，放入36℃±1℃恒温箱内培养24 h±2 h。
3挑取紫红色且具有金属光泽的菌落、深红色不带或略带金属光泽的菌落和淡红中心色较深的菌落进行革兰氏染色、镜检。
4凡革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，再接种乳糖蛋白胨培养液，于36℃±1℃培养24 h±2 h，有产酸产气者，则判定为总大肠菌群阳性。
5按公式(1)计算滤膜上生长的总大肠菌群数，以每100 mL水样中的总大肠菌群菌落数(CFU/100 mL)报告结果。
5.3 酶底物法5.3
总大肠菌群在选择性培养基上能产生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)，通过分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，以此原理来检测水中总大肠菌群的方法。
仪器 8 项试剂 2 项步骤 6 步
仪器设备
量筒（100 mL、500 mL、1 000 mL）无菌吸管（1 mL、5 mL及10 mL管）稀释瓶（100 mL、250 mL、500 mL及1 000 mL）无菌试管（约15 mm×160 mm）培养箱（36℃±1℃）高压蒸汽灭菌器定量盘（定量培养用无菌塑料盘，含51个孔穴，每一孔穴可容纳2 mL水样）封口机（用于51孔定量盘）
试剂材料
MMO-MUG培养基生理盐水
分析步骤
1定性反应：将100 mL水样加入100 mL无菌稀释瓶中，加入2.7 g MMO-MUG培养基粉末，混合均匀使之完全溶解后，放入36℃±1℃的培养箱内培养24 h。
210管法：将100 mL水样加入100 mL无菌稀释瓶中，加入2.7 g MMO-MUG培养基粉末，混合均匀使之完全溶解。准备10支无菌试管，用无菌吸管分别从前述稀释瓶中取10 mL水样至各试管中，放入36℃±1℃的培养箱中培养24 h。
351孔定量盘法：将100 mL水样加入100 mL无菌稀释瓶中，加入2.7 g MMO-MUG培养基粉末，混摇使之完全溶解均匀。将前述100 mL水样全部倒入51孔无菌定量盘内，以手抚平定量盘背面，去除孔穴内气泡，然后用程控定量封口机封口。放入36℃±1℃的培养箱中培养24 h。
4结果判读：将水样培养24 h后进行结果判读，如果结果为可疑阳性，可延长培养时间到28 h进行结果判读，超过28 h之后出现的颜色反应不作为阳性结果。
5定性反应：水样经24 h培养之后如果颜色变成黄色，判断为阳性反应，表示水中含有大肠菌群。水样颜色未发生变化，判断为阴性反应。定性反应结果以总大肠菌群检出或未检出报告。
610管法：将培养24 h之后的试管取出观察，如果试管内水样变成黄色则表示该试管含有总大肠菌群。计数有黄色反应的试管数，对照表5查出其代表的总大肠菌群MPN值。结果以MPN/100 mL表示。如所有管均未产生黄色，则可报告为总大肠菌群未检出。
51孔定量盘法5.3.5.4
将培养24h之后的定量盘取出观察，如果孔穴内的水样变成黄色则表示该孔穴中含有总大肠菌群。
仪器 0 项试剂 0 项步骤 2 步
分析步骤
1将培养24h之后的定量盘取出观察，如果孔穴内的水样变成黄色则表示该孔穴中含有总大肠菌群。
2计算有黄色反应的孔穴数，对照表6查出其代表的总大肠菌群MPN值。结果以MPN/100mL表示。如所有孔均未产生黄色，则可报告为总大肠菌群未检出。
多管发酵法6.1
经44.5℃培养24h，发酵乳糖产酸产气、经证实试验和革兰氏染色检测水中耐热大肠菌群的方法。
仪器 1 项试剂 2 项步骤 2 步
仪器设备
恒温水浴箱或恒温培养箱（44.5℃±0.5℃）
试剂材料
EC培养基伊红美蓝培养基
分析步骤
1自总大肠菌群乳糖发酵试验中的阳性管(产酸产气)中取1滴转种于EC培养基中，置44.5℃±0.5℃水浴箱或隔水式恒温培养箱内(水浴箱的水面应高于试管中培养基液面)，培养24h±2h，如所有管均不产气，则可报告为未检出，如有产气者，则转种于伊红美蓝琼脂平板上，置44.5℃±0.5℃培养18h～24h，凡平板上有典型菌落者，则证实为耐热大肠菌群阳性。
2如检测未经含氯消毒剂消毒的水，且只想检测耐热大肠菌群时，或调查水源水的耐热大肠菌群污染时，可直接用多管发酵方法，可按照5.1.4.1的要求，接种乳糖蛋白胨培养液后直接在44.5℃±0.5℃培养，以下步骤按照6.1.4.1的要求进行。
滤膜法6.2
用孔径为0.45μm的滤膜过滤水样，细菌被阻留在膜上，将滤膜贴在添加乳糖的选择性培养基上，44.5℃培养24h能形成特征性菌落，以此来检测水中耐热大肠菌群的方法。
仪器 2 项试剂 2 项步骤 4 步
仪器设备
恒温水浴箱或隔水式恒温培养箱（44.5℃±0.5℃）玻璃或塑料平皿（直径6cm或5cm）
试剂材料
MFC培养基EC培养基
分析步骤
1准备工作应符合5.2.4.1的要求。
2过滤水样应符合5.2.4.2的要求。
3培养：过滤完水样后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在MFC培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不应留有气泡，然后将平皿倒置，44.5℃±0.5℃培养24h±2h。耐热大肠菌群在此培养基上菌落为蓝色，非耐热大肠菌群菌落为灰色至奶油色。
4对可疑菌落转种EC培养基，44.5℃±0.5℃培养24h±2h，如产气则证实为耐热大肠菌群。
多管发酵法7.1
将总大肠菌群多管发酵法在初发酵时阳性的培养物，接种在含有荧光底物的培养基上，经培养产生β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)，分解荧光底物释放出荧光产物，在紫外光下产生特征性荧光的细菌，以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法。
仪器 11 项试剂 1 项步骤 2 步
仪器设备
紫外灯（6W，波长为366nm）培养箱电子天平平皿（直径9cm）无菌试管（约15mm×160mm）无菌吸管（1mL，10mL）移液器（1mL）锥形瓶（1000mL）小倒管接种环冰箱
试剂材料
EC-MUG培养基
分析步骤
1接种：用无菌接种环或无菌棉签将总大肠菌群多管发酵法在初发酵时产酸产气的试管中液体接种到EC-MUG管中。实验室生物安全要求应依据GB 19489。
2培养：将已接种的EC-MUG管在培养箱中44.5℃±0.5℃培养24h±2h。
滤膜法7.2
将总大肠菌群滤膜法检测阳性的滤膜，置于含有荧光底物的培养基上培养，能产生β-葡萄糖醛酸酶，分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法。
仪器 2 项试剂 5 项步骤 4 步
仪器设备
紫外灯（6 W, 波长为 366 nm）其他仪器设备（应符合 5.2.3 的要求）
试剂材料
蛋白胨（5.0 g）牛肉浸膏（3.0 g）琼脂（15.0 g）4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)（0.1 g）纯水（1000 mL）
分析步骤
1接种: 在无菌操作条件下将有典型菌落生长的滤膜转移到 NA-MUG 平板上, 细菌截留面朝上, 进行培养。实验室生物安全要求应符合 GB 19489 的要求。
2培养: 将已接种的 NA-MUG 平板于 36℃±1℃ 培养 4 h。
3将培养后的 NA-MUG 平板在暗处用波长为 366 nm 功率为 6 W 的紫外灯照射, 如果菌落边缘或菌落背面有蓝色荧光产生则表示该菌落为大肠埃希氏菌。
4记录有蓝色荧光产生的菌落数并报告,报告格式按总大肠菌群滤膜法的要求。
酶底物法7.3
大肠埃希氏菌在选择性培养基上能产生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)，可分解色原底物后释放出色原体使培养基呈现颜色变化，并能产生β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)，分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此技术来检测大肠埃希氏菌的方法。
仪器 2 项试剂 1 项步骤 5 步
仪器设备
紫外灯（6 W, 波长为 366 nm）其他仪器设备（应符合 5.3.3 的要求）
试剂材料
培养基与试剂（应符合 5.3.2 的要求）
分析步骤
1试验步骤应符合 5.3.4 的要求。
2结果判读应符合 5.3.5.1 的要求,对照表同总大肠菌群酶底物法中表 5 与表 6。水样变为黄色同时有蓝色荧光判断为大肠埃希氏菌阳性,水样未变黄色而有荧光产生不判定为大肠埃希氏菌阳性。
3定性反应: 将经过 24 h 培养颜色变成黄色的水样，在暗处用波长为 366 nm 的紫外灯照射，如果有蓝色荧光产生判断为阳性，表示水中含有大肠埃希氏菌。水样如未产生蓝色荧光，判断为阴性。结果以大肠埃希氏菌检出或未检出报告。
410 管法: 将培养 24h 水样颜色变成黄色的试管，在暗处用波长为 366 nm 的紫外灯照射，如果有蓝色荧光产生，则表示大肠埃希氏菌为阳性。计算有荧光反应的试管数，对照表 5 查出其代表的大肠埃希氏菌 MPN 值。结果以 MPN/100 mL 表示。如所有管均未产生荧光，则可报告大肠埃希氏菌未检出。
551 孔定量盘法: 将培养 24 h 颜色变成黄色的水样的定量盘在暗处用波长为 366 nm 的紫外灯照射, 如果有蓝色荧光产生, 则表示该定量盘孔穴中大肠埃希氏菌为阳性。计算有荧光反应的孔穴数，对照表6查出其代表的大肠埃希氏菌MPN值。结果以MPN/100 mL表示。如所有孔均未产生荧光，则可报告大肠埃希氏菌未检出。
免疫磁分离荧光抗体法8.1
采用过滤和反向冲洗技术从水样中富集贾第鞭毛虫孢囊，借助免疫磁分离技术将贾第鞭毛虫孢囊从其他杂质中分离出来，再经过酸化脱磁、异硫氰酸荧光素酯/4'6-二脒基-2-苯基吲哚(FITC/DAPI)染色，最后经过显微镜检确认和计数的方法。
仪器 52 项试剂 39 项步骤 2 步
仪器设备
蠕动泵（流量为 2 L/min）泵管滤囊（醚砜滤膜,有效过滤面积 1300 cm², 孔径 1.0 μm）夹子水表流量控制阀（压力为 0.21 MPa (对于处理水可任意选择)）过滤管塑料连接滤芯（压缩后的多孔海绵滤膜模块（600 mm 压缩到 30 mm 的 60 层多孔海绵滤膜，其中单层多孔海绵滤膜厚 10 mm，外径 55 mm，内径 18 mm））滤器（带进出水样接口及配套软管和辅助工具）蠕动泵泵管夹子水表流量控制阀（1 L/min～4 L/min）水平振荡器（有臂的水平振荡装置,臂上有垂直安装的过滤夹,最大频率 600 r/min）250 mL 锥形离心管离心机（1 500g 离心力）旋涡搅拌器塑料洗耳球10mL 吸管50 mL 吸管100 mL 的量筒Leighton 管（一侧平面试管, 125 mm × 16 mm, 带管塞, 一侧为 60 mm × 10 mm 平面）磁粒浓缩器 1（适合 Leighton 管内液体磁分离）磁粒浓缩器 2（适合微型离心管内液体磁分离）锥形具塞 5 mL 微量离心管手动或自动多孔海绵滤膜模块淘洗主设备及配套装置（浓缩管及底座，洗涤管及不锈钢虹吸管）真空泵磁力搅拌器和搅拌棒滤膜（孔径 3.0 μm, 直径 73 mm）磁粒浓缩器 1（适合 Leighton 管内液体磁分离）磁粒浓缩器 2（适合微型离心管内液体磁分离）多孔海绵滤膜模块快速淘洗装置（可压缩空气与淘洗液，自动完成8次及以上反向冲洗程序）空气压缩机（压力大于 0.5 MPa, 可压缩 15 L 空气）离心机（2000g 离心力）锥形离心管（500 mL）蠕动泵磁粒浓缩器 1（适合 Leighton 管内液体磁分离）磁粒浓缩器 2（适合微型离心管内液体磁分离）三通真空泵湿度孵化盒载玻片盖玻片培养箱荧光显微镜450 nm～480 nm 的蓝色滤光片330 nm～385 nm 的紫外光滤光片测微计移液器（5 μL～20 μL, 20 μL～200 μL, 200 μL～1 000 μL）巴斯德玻璃吸管小口塑料瓶或玻璃瓶（20 L）
试剂材料
氯化钠（8.0 g）氯化钾（0.2 g）磷酸氢二钠（1.44 g）磷酸二氢钾（0.24 g）纯水（1000 mL）抗隐孢子虫单克隆抗体磁微粒抗贾第鞭毛虫单克隆抗体磁微粒缓冲液 A（15 mL）缓冲液 B（10 mL）抗隐孢子虫/贾第鞭毛虫单克隆抗体-异硫氰酸盐荧光素试剂盒甘油/PBS 缓冲盐溶液（60%/40% 100 mL）DABCO（2.0 g）Tris 盐酸 (C4H12ClNO3)（132.2 g）Tris 碱 (C4H11NO3)（19.4 g）乙二胺四乙酸二钠盐二水化合物 (Na2EDTA·2H2O)（37.22 g）月桂醇聚醚-12(Laureth-12)（4.0 g）Tris 溶液(1 mol/L)（40 mL）Na2EDTA 二水合物溶液(0.5 mol/L)（8 mL）A 型止泡剂（600 μL）纯水（1000 mL）磷酸氢二钠（1.44 g）磷酸二氢钾（0.2 g）氯化钾（0.2 g）氯化钠（8.0 g）吐温-20（0.1 mL）纯水（1000 mL）焦磷酸四钠（0.2 g）EDTA 柠檬酸三钠（0.3 g）Tris-HCl(1 mol/L)（10 mL）吐温-80（0.1 mL）纯水（1000 mL）盐酸（0.1 mol/L）氢氧化钠（1 mol/L）分析级甲醇（分析级）DAPI（1 mg）甲醇（500 μL）DAPI 母液（10 μL）PBS（50 mL）次氯酸钠（50.0 g/L）
分析步骤
1采样: 连接滤囊以外的采样系统。打开蠕动泵的开关,并将流量调到 2 L/min。在作业线上安装滤囊，用适当的夹子将滤囊的进口和出口分别连接固定。记录水表上指示的体积。将采样系统连接到自来水龙头或其他水源上。通过滤囊过滤适当体积的水样。在过滤结束的时候，记录滤囊过滤的水样体积。将连接在水源上的采样系统取下。打开泵,尽快把滤囊放空。
2淘洗: 取下滤囊进水口的乙烯帽，用量筒加 110 mL 淘洗液 A 到每个滤囊的外腔中。将滤囊插到有臂的水平振荡器夹子上，滤囊的出水阀在 12 点钟的位置。打开振荡器的开关, 将样本振荡 10 min。将滤囊中的淘洗液 A 倾注到 250 mL 的锥形离心管中, 再将 110 mL 淘洗液 A 加入滤囊的外腔中。将过滤器插到振荡器的夹钳上，出水阀转到3点钟位置。在 80% 的功率下，再摇 10min。重复操作步骤 d)，将乙烯帽小心取下，将滤囊中的淘洗液倾注到 250 mL 的锥形离心管中。
浓缩（离心浓缩法）8.1.4.1.2.3
通过离心使沉淀物压实，吸掉上清液后根据压实沉淀物体积加纯水调整总体积并再悬浮
仪器 3 项试剂 1 项步骤 4 步
仪器设备
锥形离心管移液器旋转式搅拌器
试剂材料
纯水
分析步骤
1将装有淘洗液样本的锥形离心管置于1500g离心15min。自然减速，以免搅起沉淀物。
2用移液器小心地将上清液吸掉，使上清液刚好到沉淀物的上面（不要搅起沉淀物）。
3如果压实的沉淀物体积小于或等于0.5mL，加纯水到离心管中，使其总体积为10mL。将试管置于旋转式搅拌器上10s～15s，以便使沉淀物再悬浮。
4如果压实的沉淀物体积大于0.5mL，用公式(3)确定在离心管中需要的总体积：总需要体积(mL)=沉淀物体积×10mL/0.5mL。将再悬浮的沉淀物调整到一个0.5mL相同压实的沉淀物体积，加纯水到离心管中，使其总体积到上面计算的水平。将试管旋转搅拌10s～15s，以便使沉淀物再悬浮。记录这个再悬浮物的体积。
多孔海绵滤膜模块采样和淘洗步骤8.1.4.1.3
将滤芯安装于支架采样，过滤后取下滤芯进行淘洗，淘洗液经浓缩、离心等步骤处理
仪器 16 项试剂 1 项步骤 11 步
仪器设备
滤芯支架滤器导流泵、蠕动泵等泵类装置浓缩器浓缩管洗涤管淘洗器快接头不锈钢虹吸管磁性搅拌棒磁性搅拌盘真空泵50mL离心管3μm滤膜（3μm）自动淘洗器
试剂材料
淘洗液B
分析步骤
1采样：将滤芯(螺栓头朝下)安装在支架上，拧紧盖子(盖子即为进样口)。将滤器连接到需采样的水源进行采样。注1：为使液体流经滤芯需在顶部施加0.05MPa的压力。推荐的0.05MPa工作压力形成的液体流速为3L/min～4L/min。工作压力最大不超过0.8MPa。注2：采样时如使用导流泵、蠕动泵等泵类装置，安装在滤器上游。注3：样品采集可在水源现场或实验室完成。过滤后，于0℃～4℃冷藏避光保存滤芯，一般不要超过72h。
2手工淘洗：第一次淘洗。将3μm滤膜放置到浓缩器中，组装好浓缩管和洗涤管。将滤芯从支架上取下，安装到淘洗器的活塞顶部。将淘洗器的狭口与洗涤管用快接头连接。拉下淘洗器的延伸臂至锁住，从滤芯上去除螺栓。再连接上不锈钢虹吸管。向浓缩管注入600mL淘洗液B，随后连接到快接头上。将活塞上下活动20次，以冲洗解压的滤芯。拆下浓缩管，挤压活塞5次以清除过滤器中的残留液体。
3第一次淘洗液浓缩。将浓缩管与磁性搅拌棒连接，放置在磁性搅拌盘上，以60r/min～120r/min搅拌。将真空泵连接到浓缩器上，形成压力为13.3kPa～40.0kPa的真空。打开活栓，使流出液浓缩到30mL～40mL。将浓缩液轻轻倒入50mL离心管中。
4第二次淘洗。浓缩管中重新加入600mL淘洗液B，再连接到洗涤管上。重复第一次淘洗过程，只需10次。
5第二次淘洗液浓缩。将第一次的浓缩液加入第二次的淘洗液中。按上述方法重复浓缩过程。
6将3μm滤膜转移到提供的袋子中，加入5mL淘洗液B，隔着袋子用手轻轻摩擦滤膜。清洗2次。将清洗液与浓缩液混合。
7自动淘洗：第一次淘洗。将3μm滤膜放置到浓缩器中，组装好浓缩管和洗涤管。打开自动淘洗器电源。将滤芯从支架上取下，安装到淘洗器的活塞顶部。将淘洗器的狭口与淘洗管用快接头连接。卸下滤芯上的螺栓。再连接上不锈钢虹吸管。向浓缩管注入600mL淘洗液B，随后连接到快接头上。开始初次浸润，然后进行第一次淘洗。拆下浓缩管，清除过滤器中的残留液体。
8第一次淘洗液浓缩。将浓缩管与磁性搅拌棒连接，放置在磁性搅拌盘上，以60r/min～120r/min搅拌。将真空泵连接到浓缩器上，形成压力为13.3kPa～40.0kPa的真空。打开活栓，使流出液浓缩到30mL～40mL。将浓缩液轻轻倒入50mL离心管中。
9第二次淘洗。浓缩管中重新加入600mL淘洗液B，再连接到洗涤管上。开始淘洗。拆下浓缩管，清除过滤器中的残留液体。
10第二次淘洗液浓缩。将第一次的浓缩液加入第二次的淘洗液中。按上述方法重复浓缩过程。
11将3μm滤膜转移到提供的袋子中，加入5mL淘洗液B，隔着袋子用手轻轻摩擦滤膜。清洗2次。将清洗液与浓缩液混合。
多孔海绵滤膜模块采样及快速淘洗步骤8.1.4.1.4
采用多孔海绵滤膜模块快速压力淘洗装置全自动完成淘洗，淘洗液经离心浓缩处理
仪器 16 项试剂 2 项步骤 3 步
仪器设备
滤芯支架滤器导流泵、蠕动泵等泵类装置多孔海绵滤膜模块快速压力淘洗装置淘洗液瓶连接锁压缩空气源分流调节器快接头500mL锥形离心瓶（500mL）样品收集器支架离心瓶旋转式搅拌器Leighton管吸气装置
试剂材料
淘洗液C纯水
分析步骤
1采样：将滤芯(螺栓头朝下)安装在支架上，拧紧盖子(盖子即为进样口)；将滤器连接到需采样的水源进行采样。注1：为使液体流经滤芯需在顶部施加0.05MPa的压力。推荐的0.05MPa工作压力形成的液体流速为3L/min～4L/min。工作压力最大不超过0.8MPa。注2：采样时如使用导流泵、蠕动泵等泵类装置，安装在滤器上游。注3：样品采集可在水源现场或实验室完成。过滤后，于0℃～4℃冷藏避光保存滤囊，一般不要超过72h。注4：本方法亦适用于浊度高的水源水的采样。
2淘洗：采用符合技术参数要求的多孔海绵滤膜模块快速压力淘洗装置可使淘洗过程全自动完成，将压力淘洗装置准备就绪，向淘洗液瓶中加入足量的淘洗液C，利用连接锁将淘洗液瓶与压力淘洗装置连接，确保二者之间形成良好密封。连接压缩空气源和压力淘洗装置，保证足够的空气压力和体积。打开压力淘洗设备的舱门。滤器进样口朝上，移开样品阻留器，连接分流调节器(滤芯仍在滤器内)。将滤器倒转，用快接头连接到压力淘洗器上。将500mL锥形离心瓶放置在样品收集器支架上，关闭压力淘洗装置。开始自动淘洗。淘洗结束时，打开压力淘洗装置。卸下滤器，再取下分流调节器，打开滤器，弃掉滤芯。将离心瓶盖好，从样品收集器支架中取出。
3浓缩：将装有淘洗液样本的离心瓶置于2000g离心15min。慢慢减速，以免搅起沉淀物。记录沉淀物体积。注：勿用制动器！离心后，用吸气装置将沉淀物上层悬浮液体吸出，保留8mL～10mL液体（吸气装置的压力应小于3.3kPa）。如果压实的沉淀物体积小于或等于0.5mL，将试管置于旋转式搅拌器20s，然后将样品转入Leighton管中；用1mL纯水冲洗离心瓶二次，清洗液转入同一Leighton管中。如果压实的沉淀物体积大于0.5mL，用公式(4)确定在离心管中需要的总体积，以便将再悬浮的沉淀物调整到相当于0.5mL压实沉淀物的体积。需要的总体积(mL)=沉淀物体积×10mL/0.5mL。加纯水到离心管中，使其总体积到上面计算的水平。将试管旋转搅拌10s～15s，以便使沉淀物再悬浮。记录这个再悬浮物的体积。
免疫磁分离8.1.4.2
利用抗隐孢子虫抗体和抗贾第鞭毛虫抗体包被的磁微粒与目标物结合，通过磁粒浓缩器分离纯化
仪器 7 项试剂 5 项步骤 22 步
仪器设备
Leighton管漩涡混合器旋转式搅拌器磁粒浓缩器1磁粒浓缩器21.5mL微量离心管（1.5mL）载玻片
试剂材料
缓冲液A缓冲液B抗隐孢子虫抗体和抗贾第鞭毛虫抗体的磁微粒原液0.1mol/L盐酸（0.1mol/L）1mol/L氢氧化钠溶液（1mol/L）
分析步骤
1加1mL缓冲液A和1mL缓冲液B到Leighton管中。
2定量转移10mL水样浓缩物到Leighton管中。
3将抗隐孢子虫抗体和抗贾第鞭毛虫抗体的磁微粒原液置于漩涡混合器上搅拌，以便使珠粒悬浮。通过倒置试管的方法保证珠粒再悬浮，并确定底部没有残留的小团。
4向含有水样浓缩物和缓冲液样品的Leighton管中各加100μL上述悬浮的微粒。
5将含有样品的Leighton管固定到旋转式的搅拌器上，25r/min旋转1h。
6将试管从搅拌器上取下，然后再将其放在磁粒浓缩器1上，并将试管有平面的一边朝向磁铁。
7用手柔和地以大约90°角头尾相连地摇动试管，使试管的盖顶和基底轮流上下倾斜。以每秒大约倾斜一次的频率持续2min。
8如果磁粒浓缩器1中的样品静置10s以上，就要在进行下一个步骤之前，重复步骤8.1.4.2.8。
9立即打开顶端的盖，同时将固定在磁粒浓缩器1上的试管中的所有上清液倒到废液器中。做这一步骤时，不要摇动试管，也不要将试管从磁粒浓缩器1上取下。
10将试管从磁粒浓缩器1上取下，加1mL缓冲液A。非常柔和地将试管中的所有物质再悬浮。不要形成漩涡。
11将试管中的所有液体定量转移到有标签的1.5mL微量离心管中。
12将微量离心管放到未加磁条的磁粒子浓缩器2中，然后加入磁条。
13用手180°角轻轻地摇动试管。每秒大约摇动一个180°角，持续大约1min。在这一步结束时，珠粒和卵囊会在试管的背面形成一个褐色圆点。
14立即将固定在磁粒浓缩器2上的离心管和顶盖中的上清液吸出。如果同时处理一个以上的样品，就要在吸去每个离心管的上清液之前，进行3个180°角的摇动动作，不要扰乱磁铁邻近管壁上的附着物。不要摇动离心管。不要将离心管从磁粒浓缩器2上取下。
15将磁条从磁粒浓缩器2上取下。
16加50μL 0.1mol/L的盐酸至上述微量离心管中，涡旋混合10s。
17将试管放在磁粒浓缩器2上，室温垂直静置10min。
18用力涡旋5s～10s。
19保证所有样品都在试管的底部，然后将微量离心管放在磁粒浓缩器2上。
20再将磁条放到磁粒浓缩器2上，以大约90°角头尾相连地轻轻摇动试管。使试管的盖顶和基底轮流上下倾斜，以每秒大约倾斜一次的频率持续30s。
21准备一个载玻片，加5μL 1mol/L的氢氧化钠溶液至样品井中。
22不要将微量离心管从磁粒浓缩器2上取下。将所有样品从磁粒浓缩器2上的微量离心管中转移到有氢氧化钠的样品井中。不要扰乱试管背壁上的珠粒。
染色8.1.4.3
使用抗隐孢子虫单克隆抗体和抗贾第鞭毛虫单克隆抗体FITC工作稀释液进行荧光标记，DAPI复染
仪器 6 项试剂 6 项步骤 11 步
仪器设备
载玻片37℃培养箱湿盒巴斯德玻璃吸管盖玻片暗盒
试剂材料
纯甲醇抗隐孢子虫单克隆抗体和抗贾第鞭毛虫单克隆抗体FITC工作稀释液（1/1:Cellabs/PBS）PBSDAPI溶液（使用时配制，即加10μL 2mg/mL溶于纯甲醇中的DAPI于50mL的PBS中）纯水封固剂
分析步骤
1将有样品的载玻片置37℃培养箱中干燥不超过2h，或置室温避光自然风干。
2在该玻片上加一滴(50μL)的纯甲醇，然后让它自然干燥3min～5min。
3用试管准备所需体积(50μL)的抗隐孢子虫单克隆抗体和抗贾第鞭毛虫单克隆抗体FITC工作稀释液(1/1:Cellabs/PBS)。
4加50μL上述FITC单克隆抗体工作稀释液至玻片上。将载玻片放到湿盒中于36℃±1℃培养30min左右。
530min后，取出载玻片，然后用一个干净的顶端带有真空源的巴斯德玻璃吸管轻轻地吸掉过量的荧光素标记单克隆抗体。
6在每个玻片上加70μL的PBS，静置1min～2min后，吸掉多余的PBS。
7加50μL DAPI溶液(使用时配制，即加10μL 2mg/mL溶于纯甲醇中的DAPI于50mL的PBS中)到玻片上，然后让它在室温静置2min左右。
8吸掉过量的DAPI溶液。
9加70μL的PBS到玻片上，静置1min～2min后，吸掉多余的PBS。
10加70μL的纯水到玻片上，静置1min后，吸掉多余的纯水。
11让载玻片在暗处干燥后，加一滴封固剂，盖上盖玻片，然后将它存放在干燥的暗盒中，备查。注：如使用商用染色试剂盒，可按照试剂盒内说明书要求进行染色。
滤膜浓缩/密度梯度分离荧光抗体法8.2
首先通过微孔滤膜法过滤水样浓缩样品或加入氯化钙溶液和碳酸氢钠溶液形成碳酸钙沉淀浓缩样品，将浓缩后的样品通过密度梯度离心进行分离纯化，然后将纯化后的样品经免疫荧光染色，通过荧光显微镜对贾第鞭毛虫孢囊进行定性分析和定量检测。
仪器 23 项试剂 18 项步骤 2 步
仪器设备
富集过滤装置（配置蠕动泵(最大频率 600 r/min)和硅胶管的不锈钢过滤器(直径 142 mm)或同等功能的一体化过滤装置）离心机（可离心 15 mL 锥形离心管和 500 mL 离心杯, 离心力可达到 2000g, 可进行刹车挡位选择）pH 计磁力搅拌器（搅拌容量涵盖 10 L）真空抽滤器涡旋振荡器真空泵（压力可调范围为 0 mmHg ~ 5 mmHg）显微镜（荧光装置和微分干涉装置。450 nm～480 nm 蓝色滤光片；330 nm～385 nm 紫外滤光片；20 倍、40 倍、100 倍物镜）采样桶（10 L、50 L。材质为聚乙烯）平底桶（10 L, 材质为聚丙烯）无齿镊子密度计（量程涵盖 1.10 g/cm³ ~ 1.15 g/cm³）免疫组化笔电子天平烧杯（100 mL 和 1 000 mL）容量瓶（1 mL、10 mL、100 mL 和 1 000 mL）混合纤维素酯微孔滤膜（孔径 1 μm, 直径 142 mm）醋酸纤维微孔滤膜（孔径 3 μm, 直径 25 mm）载玻片盖玻片锥形底离心管（15 mL、50 mL。材质为聚丙烯）离心杯（500 mL）巴斯德玻璃吸管
试剂材料
纯水（GB/T 6682, 一级）丙酮（φ(CH3COCH3)≥99.5%）乙醇（φ(C2H5OH)=75%）Percoll-蔗糖溶液（密度 1.10 g/cm³~1.15 g/cm³）磷酸盐缓冲液(PBS)（pH 7.2~7.4）磷酸盐吐温缓冲液(PBST)DABCO-甘油牛血清蛋白(BSA)溶液（ρ(BSA)=1.0 g/L）DAPI 染色液免疫荧光试剂（抗贾第鞭毛虫单克隆抗体-异硫氰荧光素试剂盒）脱水剂 30脱水剂 70脱水剂 90贾第鞭毛虫孢囊（每份溶液中含 100 个贾第鞭毛虫孢囊）氯化钙溶液（c(CaCl2)=1.0 mol/L）碳酸氢钠溶液（c(NaHCO3)=1.0 mol/L）氢氧化钠溶液（c(NaOH)=10 mol/L）氨基磺酸溶液（ρ(NH2SO3H)=97.0 g/L）
分析步骤
1采样：根据水样类型不同，采集不同体积水样：水源水宜采集 10 L，生活饮用水宜采集 50 L。
2样品保存：样品采集后若不能立即处理，可于 1℃~10℃ 冷藏保存，在 72 h 内进行浓缩处理。
微孔滤膜过滤法8.2.4.2.1
仪器 6 项试剂 6 项步骤 5 步
仪器设备
不锈钢过滤器蠕动泵锥形底离心管（50 mL）离心管（15 mL）涡旋振荡器平头镊子
试剂材料
混合纤维素酯微孔滤膜纯水PBST75%乙醇（75%）丙酮PBS
分析步骤
1将不锈钢过滤器通过软管经蠕动泵和水样相连。将混合纤维素酯微孔滤膜正面向上置于过滤装置上，用纯水淋洗滤膜使滤膜与滤器间无气泡，安装好过滤器。打开蠕动泵过滤水样。若过滤压力过大(流速低于0.3 L/min时)，可更换新的滤膜重复上述步骤。水样过滤完之后，依次用约200 mL的PBST、75%乙醇和纯水清洗采样桶，并将清洗液过滤。过滤结束后，打开过滤装置，使用平头镊子将滤膜正面向内多次对折，将折叠好的滤膜置于50 mL的锥形底离心管中。若使用多张滤膜，可放置于同一50 mL锥形底离心管中。
2向上述 50 mL 锥形底离心管中加入丙酮至 40 mL，摇晃混匀使滤膜完全溶解。将溶解液分装进 4 个 15 mL 离心管中，在 1050 g 条件下离心 10 min（勿用制动器，减速度为 0）。离心结束后，用吸管吸去上清液，留下沉淀物。再次向 50 mL 锥形底离心管中加入 40 mL 丙酮进行混匀，混合液分装至上述 4 个 15 mL 离心管中，混匀后在 1050 g、20 ℃ 条件下离心 10 min（勿用制动器，减速度为 0）。离心结束后，用吸管吸去上清液至盛水的烧杯中，检查上清液是否因含混合纤维素酯滤膜而遇水后生成白色絮体。如有，再次向有白色絮体的 15 mL 离心管中添加丙酮并离心去上清液，直至上清液遇水无白色絮体生成。
3向上述 4 个 15 mL 离心管离心后的沉淀物中分别加入 1.25 mL 75% 乙醇，轻轻混匀，再缓慢加入 PBS 至 10 mL。2 000 g、20 ℃ 条件下离心 10 min（勿用制动器，减速度为 0）。离心后吸去上清液，保留沉淀物。记录 4 个 15 mL 离心管中沉淀物的总体积为 V。
4若沉淀物总体积 V 小于或等于 2 mL，向上述 4 个 15 mL 离心管浓缩后的沉淀物中各加入 2.5 mL 的 PBST，置于涡旋振荡器上振荡 1 min 混匀。并且记录该样品的 V1=V。
5若沉淀物总体积 V 大于 2 mL，向上述 4 个 15 mL 离心管浓缩后的沉淀物中需各加入的 PBST 体积为 1.25 倍的 V。置于涡旋振荡器上振荡 1 min 混匀。将 4 个 15 mL 离心管中的混合液分装至多个 15 mL 离心管，保证每个离心管内样品体积不超过 3 mL。该样品用于后续分离纯化和染色镜检的离心管数量最好大于或等于 4 个，V1 为用于后续分离纯化和染色镜检的液体体积的 1/6。
碳酸钙沉淀法8.2.4.2.2
仪器 5 项试剂 6 项步骤 7 步
仪器设备
平底桶（10 L）磁力搅拌器离心杯（500 mL）离心管（15 mL）涡旋振荡器
试剂材料
氯化钙溶液碳酸氢钠溶液氢氧化钠溶液氨基磺酸溶液PBSTPBS
分析步骤
1将水样转入 10 L 平底桶，置于磁力搅拌器上，边搅拌边加入 100 mL 氯化钙溶液，待混匀后边搅拌边加入 100 mL 碳酸氢钠溶液。
2用氢氧化钠溶液调节 pH 至 10，静置 12 h～16 h 后使用软管通过虹吸效应吸去上清液，余下约 200 mL 沉淀物。
3加入 200 mL 的氨基磺酸溶液溶解余下的沉淀物，转移至 500 mL 离心杯中，用少量 PBST 分次洗涤平底桶，将洗涤液均加入上述 500 mL 离心杯中。在 2000 g、20 ℃ 条件下离心 10 min（勿用制动器，减速度为 0），弃去上清液，留下沉淀物。
4向离心杯中加入约 15 mL PBST，摇匀后平均分配至 4 个 15 mL 离心管中，再用 15 mL PBST 分 3 次洗涤离心杯，均分别转移至上述 15 mL 离心管中。在 2000 g、20℃ 条件下离心 10 min（勿用制动器，减速度为 0），吸去上清液，保留沉淀物。向上述各 15 mL 离心管的沉淀物中添加 PBS 至 10 mL，混匀，在 2000 g、20℃ 条件下离心 10 min（勿用制动器，减速度为 0），吸去上清液，保留沉淀物。记录 4 个 15 mL 离心管中沉淀物的总体积为 V。
5若沉淀物总体积 V 小于或等于 2 mL，向上述浓缩后的沉淀物中各加入 2.5 mL 的 PBST，置于涡旋振荡器上振荡 1 min 混匀。并且记录 V1=V。
6若沉淀物总体积 V 大于 2 mL，向上述 4 个 15 mL 离心管浓缩后的沉淀物中需各加入的 PBST 体积为 1.25 倍的 V。置于涡旋振荡器上振荡 1 min 混匀。将 4 个 15 mL 离心管中的混合液分装至多个 15 mL 离心管，保证每个离心管内样品体积不超过 3 mL。该样品用于后续分离纯化和染色镜检的离心管数量最好大于或等于 4 个，V1 为实际用于后续分离纯化和染色镜检的液体体积的 1/6。
7水样量大于 10 L 时，根据水样体积重复步骤 8.2.4.2.2.1～8.2.4.2.2.4，并根据 15 mL 离心管中沉淀物的体积选择步骤 8.2.4.2.2.5 或者 8.2.4.2.2.6 进行沉淀物重悬。
分离纯化8.2.4.3
仪器 3 项试剂 2 项步骤 1 步
仪器设备
巴斯德玻璃吸管塑料吸管离心管（15 mL）
试剂材料
Percoll-蔗糖溶液PBST
分析步骤
1将每个 15 mL 离心管内溶液混匀，然后用巴斯德玻璃吸管从溶液底部缓慢加入 5 mL Percoll-蔗糖溶液，加入过程中避免搅混两种溶液。在 1050 g、20 ℃ 条件下离心 10 min（勿用制动器，减速度为 0）。离心结束后，用塑料吸管取中间层（从中间层上部吸取）富含孢囊的混合液于新的 15 mL 离心管中。同一个样品的孢囊混合液可放置于同一离心管中。向离心后的沉淀物中添加 2.5 mL 的 PBST，混匀。再次从溶液底部缓慢加入 5 mL Percoll-蔗糖溶液按照上述步骤进行二次分离纯化，纯化后取中间层混合液。与上述混合液合并。
染色8.2.4.4
仪器 5 项试剂 10 项步骤 5 步
仪器设备
免疫组化笔镊子真空抽滤器载玻片盖玻片
试剂材料
醋酸纤维滤膜纯水PBSBSA 溶液免疫荧光试剂DAPI 染色溶液脱水剂 30脱水剂 70脱水剂 90DABCO-甘油
分析步骤
1用免疫组化笔在醋酸纤维滤膜的外周画圆圈，再用镊子将滤膜平移至纯水液面上使其反面湿润。操作时滤膜不要浸入液面。
2将上述醋酸纤维滤膜用平头镊子平移至真空抽滤器上，用吸管吸取上述混合液逐滴加到圆圈内进行抽滤。滴加时避免将混合液溅到圆圈外。抽滤过程中，滤膜上要保持有一薄层液面，以防止滤膜干燥后破损。抽滤液体后，用 3 mL PBS 淋洗 15 mL 离心管，淋洗液用上述方法抽滤。抽滤液体后，在滤膜圆圈内滴加 0.50 mL BSA 溶液，保持 2 min，若圆圈内仍有明显液体残留则继续抽滤。
3用镊子将滤膜平移至载玻片上，在滤膜圆圈内滴加一滴免疫荧光试剂。将载玻片置于潮湿暗环境中，在室温条件下避光静置 30 min。再向滤膜圆圈内滴加 0.10 mL DAPI 染色溶液，室温条件下避光静置 10 min。
4用镊子将滤膜平移至真空抽滤器上进行抽滤，在滤膜圆圈内滴加 4 mL PBS 进行淋洗。抽滤液体后，依次向圆圈内滴加各 3 mL 的脱水剂 30、脱水剂 70 和脱水剂 90 进行抽滤。
5于新的载玻片上滴加1滴DABCO-甘油，用镊子将上述滤膜平行移到有DABCO-甘油的载玻片上。再在滤膜圆圈内滴加一滴DABCO-甘油，盖上盖玻片(不要有气泡)并进行固定。于 0℃～4℃ 冷藏避光保存，保存期为7d。
镜检8.2.4.5
仪器 0 项试剂 0 项步骤 1 步
分析步骤
1应符合 8.1.4.4 的要求。对滤膜圆圈内全部样品进行计数。
多管发酵法10.1
多管发酵法计数基于泊松分布的 MPN 理论,用于估算出样品单位体积中细菌数的 MPN 值。本试验中选择使用肠球菌肉汤,因其中含有叠氮化钠,有利于肠球菌生长的同时抑制革兰氏阴性菌的繁殖。
仪器 0 项试剂 3 项步骤 0 步
试剂材料
肠球菌肉汤培养基肠球菌琼脂(胆汁七叶苷叠氮钠琼脂)培养基胆汁七叶苷琼脂培养基(BEA)
增菌液发酵试验（多管发酵法）10.1.4
仪器 14 项试剂 8 项步骤 5 步
仪器设备
高压蒸汽灭菌器电炉恒温培养箱（35℃±2℃、35℃±0.5℃、45℃±0.5℃）冰箱电子天平显微镜pH计平皿（直径9 cm）试管（18 mm×180 mm，15 mm×160 mm）无菌吸管（1 mL、10 mL）锥形瓶（500 mL）酒精灯接种环载玻片
试剂材料
肠球菌肉汤（含七叶苷、柠檬酸铁、胆盐、蛋白胨、琼脂）（蛋白胨8.0 g、胆盐20.0 g、柠檬酸铁0.5 g、七叶苷1.0 g、琼脂15.0 g、纯水1000 mL）脑心浸液肉汤(BHIB)培养基（牛心粉5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、葡萄糖2.0 g、氯化钠5.0 g、无水磷酸氢二钠2.5 g、纯水1000 mL，pH 7.0～7.4）含6.5%氯化钠脑心浸液肉汤培养基（BHIB培养基（除纯水外其他成分同10.1.2.4）、氯化钠65.0 g、纯水1000 mL，pH 7.0～7.4）脑心浸萃琼脂(BHIA)培养基（幼牛脑浸萃200.0 g、牛心浸萃250.0 g、眯胨10.0 g、葡萄糖2.0 g、氯化钠5.0 g、无水磷酸氢二钠2.5 g、琼脂15.0 g、纯水1000 mL，pH 7.0～7.4）革兰氏染色液（应符合5.1.2.4的要求）无菌生理盐水肠球菌琼脂平板BEA平板
分析步骤
1以无菌操作方法用无菌吸管吸取10 mL充分混匀的水样接种到10 mL双料肠球菌肉汤培养液中，取1 mL水样接种到10 mL单料肠球菌肉汤培养液中。另取1 mL水样注入到9 mL无菌生理盐水中，充分混匀后取1 mL（即0.1 mL水样）注入到10 mL单料肠球菌肉汤培养液中。每一稀释度平行接种3管。
2当生活饮用水可能处于较为严重的污染时，应加大稀释度，可接种1 mL、0.1 mL、0.01 mL或0.1 mL、0.01 mL、0.001 mL，每个稀释度接种3管，每个水样共接种9管。宜选择包含阴性反应终点，即含有非3管全部发酵最低稀释度的3个连续稀释度。接种1 mL以下水样时，应作10倍递增稀释后，取1 mL水样接种到9 mL无菌生理盐水中，充分混匀后取1 mL再进行稀释。每次更换1支1 mL无菌吸管。
3将肠球菌肉汤管置于35℃±2℃培养箱内，培养24 h±2 h。若肠球菌肉汤无明显黑色沉淀，则可报告肠球菌未检出。如肠球菌肉汤呈现明显黑色沉淀，则按下列步骤进行。
4分离培养：将带黑色沉淀的肠球菌肉汤增菌液分别接种于肠球菌琼脂平板，于35℃±2℃培养24 h±2 h。观察菌落形态，挑取有棕色菌环的棕黑色大菌落10个，进行革兰氏染色、镜检和证实试验。
5证实试验：挑取10个典型菌落，同时接种BHIB肉汤和BHIA平板，BHIB肉汤置35℃±0.5℃培养24 h±2 h，BHIA平板置35℃±0.5℃培养48 h±2 h。纯培养后BHIB肉汤分别接种BEA平板，6.5%氯化钠BHIB肉汤和BHIB肉汤。将BEA平板和6.5%氯化钠BHIB肉汤置于35℃±0.5℃培养48 h±2 h；BHIB肉汤置于45℃±0.5℃培养48 h±2 h，观察细菌生长情况。挑取BHIA平板上生长菌落进行革兰氏染色。染色镜检为革兰氏染色阳性球菌；BEA平板上生长并水解七叶苷（形成黑色或棕色沉淀）；6.5%氯化钠的BHIB肉汤35℃±0.5℃生长良好；BHIB肉汤45℃±0.5℃生长；具备以上特征的典型菌落可证实为肠球菌。
滤膜法10.2
用孔径为0.45 μm的滤膜过滤水样后，将滤膜置于CATC培养基上培养，计数滤膜表面上培养出的红色小菌落数。根据证实试验计算每100 mL样品中含有的肠球菌数。
仪器 1 项试剂 1 项步骤 0 步
仪器设备
滤膜（孔径0.45 μm）
试剂材料
CATC培养基
滤膜法（产气荚膜梭状芽孢杆菌）11.1
采用滤膜过滤器，用孔径为0.45 μm的滤膜过滤水样，细菌被阻留在膜上，将滤膜的截留面朝下贴在SPS培养基上，36 ℃厌氧培养18 h～24 h后，计数黑色菌落数，挑选5个可疑菌落进行证实试验。产气荚膜梭状芽孢杆菌是能够分解乳糖产酸产气，产卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐的革兰氏阳性杆菌，结合证实试验结果与计数结果，计算得到100 mL样品中产气荚膜梭状芽孢杆菌数的方法。
仪器 13 项试剂 9 项步骤 4 步
仪器设备
电子天平pH计或精密pH试纸恒温培养箱（36 ℃±1 ℃）冰箱恒温水浴箱（46 ℃±1 ℃）显微镜无菌吸管（1 mL、10 mL或移液器）无菌试管（18 mm×180 mm）无菌平皿（直径9 cm）厌氧培养装置过滤设备（配备滤器和抽滤装置）滤膜（孔径为0.45 μm）无齿镊子
试剂材料
0.1%缓冲蛋白胨水（蛋白胨1.0 g，纯水1000 mL，pH 6.8～7.2）亚硫酸盐-多黏菌素-磺胺嘧啶(SPS)琼脂（胰酶消化酪蛋白胨15.0 g，酵母浸粉10.0 g，柠檬酸铁铵1.0 g，琼脂15.0 g，纯水1000 mL，亚硫酸钠溶液(100 g/L)10 mL，多黏菌素B硫酸盐溶液(1.2 g/L)10 mL，磺胺嘧啶钠溶液(12.0 g/L)10 mL，pH 6.8～7.2）液体硫乙醇酸盐(FT)培养基（胰酶消化酪蛋白胨15.0 g，L-胱氨酸0.5 g，酵母浸粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，氯化钠2.5 g，硫乙醇酸钠0.5 g，刃天青0.001 g，琼脂0.75 g，纯水1000 mL，pH 6.9～7.3）含铁牛乳培养基（新鲜全脂牛奶1000 mL，七水合硫酸亚铁1.0 g，纯水50.0 mL）缓冲动力-硝酸盐培养基（蛋白胨5.0 g，牛肉浸粉3.0 g，硝酸钾5.0 g，无水磷酸氢二钠2.5 g，半乳糖5.0 g，甘油5.0 mL，琼脂3.0 g，纯水1000 mL，pH 7.1～7.5）卵黄琼脂培养基（肉浸液1000 mL，蛋白胨15.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂15.0 g～20.0 g，葡萄糖溶液(500 g/L)20 mL，卵黄盐悬液(500 g/L)100 mL～150 mL，pH 7.4～7.6）硝酸盐还原试剂甲液(对氨基苯磺酸溶液)（8.0 g对氨基苯磺酸溶于1000 mL乙酸溶液[c(CH3COOH)=5 mol/L]中）硝酸盐还原试剂乙液(α-萘酚乙酸溶液)（5.0 g α-萘酚溶于1000 mL乙酸溶液[c(CH3COOH)=5 mol/L]中）革兰氏染色液（应符合5.1.2.4的要求）
分析步骤
1滤膜灭菌：将滤膜放入烧杯中，加入纯水，煮沸灭菌3次，15 min/次，前两次煮沸后需换水洗涤2次～3次。或使用符合要求的商用一次性无菌滤膜。
2滤器灭菌：滤器经121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。或使用符合要求的商用一次性无菌滤器。
3过滤水样：先用无菌镊子夹取无菌滤膜边缘部分，将滤膜正面朝上贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将100 mL水样注入滤器中，打开滤器阀门，在-5.07×10^4 Pa(-0.5大气压)下抽滤。每次试验均需要用100 mL 0.1%缓冲蛋白胨水进行空白对照。
4培养：过滤完水样后，关上滤器阀门，取下滤器，用无菌镊子夹取滤膜边缘部分，移滤膜倒置在SPS琼脂培养基上，滤膜截留细菌面与培养基完全贴紧，避免气泡产生，然后将平皿倒置于厌氧培养装置内，于36 ℃±1 ℃厌氧培养18 h～24 h，计数黑色菌落数。
证实试验11.1.5.6
挑取可疑黑色菌落接种FT培养基培养后，通过革兰氏染色镜检、含铁牛乳暴烈发酵试验、缓冲动力-硝酸盐培养基动力与硝酸盐还原试验、卵黄琼脂平板卵磷脂酶试验进行证实。
仪器 4 项试剂 8 项步骤 5 步
仪器设备
无菌镊子接种针水浴（46 ℃±1 ℃）培养箱（36 ℃±1 ℃）
试剂材料
FT培养基含铁牛乳培养基液体石蜡缓冲动力-硝酸盐培养基甲液(对氨基苯磺酸液)乙液(α-萘酚乙酸溶液)锌粉卵黄琼脂平板
分析步骤
1使用无菌镊子夹住滤膜边缘，缓缓掀起，以免菌落脱落或被蹭花，翻转滤膜，使菌落生长面朝上，从滤膜或培养基上挑取上述平板上生长的5个可疑黑色菌落（小于5个时应全部挑取），分别接种于FT培养基，于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h，该培养物用于证实试验。
2用上述培养液涂片，革兰氏染色、镜检。产气荚膜梭状芽孢杆菌为革兰氏阳性粗大杆菌，其耐热菌株可能形成卵形芽孢，位于菌体中央或近端，其宽度一般不超过菌体宽度。
3取生长旺盛的FT培养液1 mL，接种于10 mL含铁牛乳培养基底部，加入1 cm～2 cm高液体石蜡，以隔绝氧气，于46 ℃±1 ℃水浴中培养2 h，然后每小时观察一次有无“暴烈发酵”现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，通常会上升到培养基表面。5 h内不发酵者为阴性。产气荚膜梭状芽孢杆菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。
4用接种针取FT培养液穿刺接种于缓冲动力-硝酸盐培养基，于36 ℃±1 ℃厌氧培养24 h±2 h。在透射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况，判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长，无动力的菌株沿穿刺线生长而无扩散生长。滴加0.5 mL甲液(对氨基苯磺酸液)和0.2 mL乙液（α-萘酚乙酸溶液）以检查亚硝酸盐的存在。15 min内出现红色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐；如果不出现颜色变化，则加少许锌粉，放置10 min，出现红色者，表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭状芽孢杆菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
5用接种针取FT培养液点种于卵黄琼脂平板(每个平板至少可接种10点)，于36 ℃±1 ℃厌氧培养24 h±2 h，观察接种点的变化。产气荚膜梭状芽孢杆菌会产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部及周围形成乳白色的浑浊带。
公式已就位——生成原始记录后，这些公式将变成 Excel 里的活公式，改读数自动重算重判
总大肠菌群菌落数计算公式5.2.5.3
\text{总大肠菌群菌落数}(CFU/100mL) = \dfrac{\text{数出的总大肠菌群菌落数} × 100}{\text{过滤的水样体积}(mL)}
计算表达式（可直接用于 Excel/程序）
总大肠菌群菌落数(CFU/100mL) = (数出的总大肠菌群菌落数 × 100) / 过滤的水样体积(mL)
数出的总大肠菌群菌落数数出的总大肠菌群菌落数CFU
过滤的水样体积过滤的水样体积mL
耐热大肠菌菌落数6.2.5
\text{耐热大肠菌菌落数}(CFU/100mL) = \dfrac{\text{所计得的耐热大肠菌菌落数} × 100}{\text{过滤的水样体积}(mL)}
计算表达式（可直接用于 Excel/程序）
耐热大肠菌菌落数(CFU/100mL) = (所计得的耐热大肠菌菌落数 × 100) / 过滤的水样体积(mL)
所计得的耐热大肠菌菌落数滤膜上生长的耐热大肠菌菌落数CFU
过滤的水样体积过滤的水样体积mL
总需要体积计算（离心浓缩）8.1.4.1.2.3
\text{总需要体积}(mL) = \dfrac{\text{沉淀物体积} × 10 mL}{0.5 mL}
计算表达式（可直接用于 Excel/程序）
总需要体积(mL) = 沉淀物体积 × 10 mL / 0.5 mL
沉淀物体积压实的沉淀物体积mL
总需要体积离心管中需要的总体积mL
需要的总体积计算（快速淘洗浓缩）8.1.4.1.4.3
\text{需要的总体积}(mL) = \dfrac{\text{沉淀物体积} × 10 mL}{0.5 mL}
计算表达式（可直接用于 Excel/程序）
需要的总体积(mL) = 沉淀物体积 × 10 mL / 0.5 mL
沉淀物体积压实的沉淀物体积mL
需要的总体积离心管中需要的总体积mL
每10升样本中的孢(卵)囊数8.1.5.1
Y = \dfrac{X × V}{(V1 × V2) × 10}
计算表达式（可直接用于 Excel/程序）
Y = (X × V) / (V1 × V2) × 10
Y每10升水中孢囊或卵囊的数目个/10 L
X计数样本的体积中孢囊或卵囊的数目个
V离心后再悬浮的体积mL
V1计数样品的体积mL
V2过滤后水的体积L
分析的检测限8.1.5.2
D = \dfrac{V}{V1 × V2}
计算表达式（可直接用于 Excel/程序）
D = V / (V1 × V2)
D每升孢囊或卵囊的检测限
V离心后再悬浮的体积mL
V1计数样品的体积mL
V2过滤后水的体积L
每10升样本中孢囊数8.2.5.1
Y = \dfrac{X × V}{(V1 × V2) × 10}
计算表达式（可直接用于 Excel/程序）
Y = (X × V) / (V1 × V2) × 10
Y每 10 升样本中孢囊的数目个/10 L
X计数样本的体积中孢囊的数目个
V水样浓缩后所得沉淀物总体积mL
V1用于镜检计数的沉淀物体积mL
V2采集的水样体积L
分析相对标准偏差8.2.5.2
RSD = (\sqrt{\dfrac{Σ(xi - x̄)²}{n - 1}} / x̄) × 100\%
计算表达式（可直接用于 Excel/程序）
RSD = (sqrt(Σ(xi - x̄)² / (n - 1)) / x̄) × 100%
RSD相对标准偏差
x孢囊数目的平均值个
xi孢囊的数目个
n测定次数
平均值8.2.6.2.3.1
x̄ = (1/N) Σ xi
计算表达式（可直接用于 Excel/程序）
x̄ = (1/N) Σ xi
x̄平均值
N总样本数
i为第 i 个样本
标准差8.2.6.2.3.1
σ = \sqrt{(1/N) Σ (xi - x̄)²}
计算表达式（可直接用于 Excel/程序）
σ = sqrt((1/N) Σ (xi - x̄)²)
σ标准差
N总样本数
i为第 i 个样本
x̄平均值
肠球菌数计算公式10.2.5
\text{肠球菌数}(CFU/100 mL) = \dfrac{(A + B) × C}{2 × D × d}
计算表达式（可直接用于 Excel/程序）
肠球菌数(CFU/100 mL) = (A + B) × C / (2 × D × d)
A滤过100 mL水样中平板1表面疑似肠球菌典型菌落数CFU/100 mL
B滤过100 mL水样中平板2表面疑似肠球菌典型菌落数CFU/100 mL
C证实为阳性的肠球菌菌落数CFU
D用于证实试验的肠球菌菌落数CFU
d每100 mL过滤水中实际水样的比例
产气荚膜梭状芽孢杆菌菌落数计算公式11.1.6.2
\text{产气荚膜梭状芽孢杆菌菌落数}(CFU/100 mL) = \dfrac{A × B}{C × d}
计算表达式（可直接用于 Excel/程序）
产气荚膜梭状芽孢杆菌菌落数(CFU/100 mL) = (A × B) / (C × d)
A过滤100 mL水样中滤膜上可疑的黑色菌落数CFU/100 mL
B证实为产气荚膜梭状芽孢杆菌的菌落数CFU
C用于证实试验的产气荚膜梭状芽孢杆菌的菌落数CFU
d每100 mL过滤水中实际水样的比例
标准中"施加在执行过程与条件上的要求"（C1 环境 / C4 样品 / C6 质控 / C7 条件限值 / C8 适用范围 / C9 过程参数），是原始记录模板与自动核查的数据源。
C1 · 环境条件培养箱 · 培养温度
36±1 ℃培养盘倒置培养出处：4.2.3.11
C1 · 环境条件培养箱 · 培养温度
36±1 ℃接种管培养出处：5.1.3.10
C1 · 环境条件培养箱 · 培养温度
36±1 ℃平皿倒置培养出处：5.2.3.4
C1 · 环境条件培养箱 · 培养温度
36±1 ℃培养箱设备要求出处：5.3.3.4
C1 · 环境条件培养箱 · 培养温度与时间
放入 36^{\circ}C ± 1^{\circ}C 的培养箱中培养 24 h定量盘培养出处：5.3.3.8
C2 · 试验介质/溶液培养基 · pH
7.4 ~ 7.6 pH将上述成分混合后加热溶解出处：1
C2 · 试验介质/溶液营养琼脂培养基 · 倾注温度
45±None ℃已融化并冷却出处：4.1.3.8
C2 · 试验介质/溶液培养基 · pH
6.7 ~ 7.3 pH将上述成分溶解于纯水中出处：4.1.3.8
C2 · 试验介质/溶液培养基 · pH
7.2 ~ 7.4蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于纯水后出处：4.2.3.11
C2 · 试验介质/溶液培养基 · 灭菌温度
115±None ℃高压蒸汽灭菌出处：4.2.3.11
C2 · 试验介质/溶液培养基 · 灭菌时间
20±None min115℃高压蒸汽灭菌出处：4.2.3.11
C2 · 试验介质/溶液培养基 · 琼脂用量
20.0 ~ 30.0 g培养基配制出处：4.2.3.11
C2 · 试验介质/溶液培养基 · pH
7.2±None蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于纯水后出处：4.2.3.11
C2 · 试验介质/溶液培养基 · 灭菌温度
115±None ℃高压蒸汽灭菌出处：4.2.3.11
C2 · 试验介质/溶液培养基 · 灭菌时间
20±None min115℃高压蒸汽灭菌出处：4.2.3.11
C2 · 试验介质/溶液培养基 · 琼脂用量
15.0 ~ 20.0 g培养基配制出处：5.1.3.10
C2 · 试验介质/溶液培养基 · pH
7.2 ~ 7.4 pH混匀后调pH出处：5.1.3.10
C2 · 试验介质/溶液培养基 · 灭菌条件及pH
6.7 ~ 7.1 pH115℃高压蒸汽灭菌20min后出处：5.3.3.8
C2 · 试验介质/溶液允许培养基配制 · pH及配制条件
混匀调 pH 为 7.4，加入苯胺蓝煮沸，迅速离开热源，待冷却至 60 ℃ 左右，制成平板，不可高压蒸汽灭菌调pH为7.4，冷却至60℃左右制成平板，不可高压蒸汽灭菌出处：6.1.4.2
C2 · 试验介质/溶液强制培养基存放 · 存放温度与时间
2 ~ 10 ℃制好的培养基存放不超过96h出处：6.1.4.2
C2 · 试验介质/溶液培养基 · 灭菌条件及pH
6.7 ~ 7.1 pH366nm紫外灯下检查无自发荧光后，115℃高压蒸汽灭菌20min出处：6.2.4.4
C2 · 试验介质/溶液培养基 · 灭菌条件及pH
6.6 ~ 7.0 pH121℃高压蒸汽灭菌15min后出处：7.1.4.2
C2 · 试验介质/溶液允许缓冲液/溶液 · pH及保存条件
7.1 ~ 7.3 pH上述成分混合溶解于纯水中后出处：7.3.3.2
C2 · 试验介质/溶液Tris 溶液 · pH
7.3 ~ 7.5 pH用 1 mol/L 盐酸或氢氧化钠溶液调节出处：7.3.3.2
C2 · 试验介质/溶液允许Na2EDTA 溶液 · pH及保存条件
7.9 ~ 8.1 pH将 37.22 g 乙二胺四乙酸二钠盐二水化合物溶解到 200 mL 纯水中后出处：7.3.3.2
C2 · 试验介质/溶液含吐温-80 的稀释溶液 · pH
7.2 ~ 7.6 pH用纯水稀释至 1000 mL 后出处：7.3.3.2
C2 · 试验介质/溶液甲醇 · 甲醇含量
≥ 99.5 %分析级甲醇出处：7.3.3.2
C2 · 试验介质/溶液允许DAPI 溶液 · 保存温度及时间
0 ~ 4 ℃冷藏避光保存出处：7.3.3.2
C2 · 试验介质/溶液DAPI 工作液 · 保存温度
0 ~ 4 ℃用 50 mL PBS 稀释 10 μL DAPI 母液，用时配制出处：7.3.3.2
C2 · 试验介质/溶液允许试剂 · 保存温度与有效期
0 ~ 4 ℃冷藏保存条件下可使用7 d出处：8.2.2.5
C2 · 试验介质/溶液允许BSA溶液 · 保存温度与有效期
0 ~ 4 ℃冷藏保存可使用1个月出处：8.2.2.8
C2 · 试验介质/溶液允许DAPI储备液 · 保存温度与有效期
-20±None ℃避光保存可使用1年出处：8.2.2.8
C2 · 试验介质/溶液DAPI染色液 · 保存温度与使用期限
0 ~ 4 ℃冷藏避光保存并在当日使用出处：8.2.2.9
C2 · 试验介质/溶液允许脱水剂 · 保存温度与有效期
0 ~ 4 ℃冷藏保存可使用1年出处：8.2.2.11
C2 · 试验介质/溶液肠球菌肉汤培养基 · pH
7.0 ~ 7.4加热煮沸溶解、冷却后出处：9.2.2.3
C2 · 试验介质/溶液培养基 · pH/灭菌条件/倾注温度
调节 pH 至 7.0～7.4，121 ℃ 高压蒸汽灭菌 15 min，于 45 ℃～50 ℃ 倾注平板备用出处：9.2.2.3
C2 · 试验介质/溶液培养基 · 灭菌条件/倾注温度
121 ℃高压蒸汽灭菌 15 min,于 45 ℃~50 ℃倾注平板备用出处：9.2.2.3
C2 · 试验介质/溶液培养基 · pH
7.0 ~ 7.4 pH冷却后调节出处：9.2.2.3
C2 · 试验介质/溶液培养基 · pH
7.0 ~ 7.4 pH冷却后调节出处：9.2.2.3
C2 · 试验介质/溶液缓冲蛋白胨水 · pH
6.8 ~ 7.20.1%缓冲蛋白胨水配制出处：10.2.3.16
C2 · 试验介质/溶液基础培养基 · pH
6.8 ~ 7.2基础成分溶解后出处：10.2.3.16
C2 · 试验介质/溶液硫乙醇酸盐培养基 · pH
6.9 ~ 7.3成分溶解冷却后出处：10.2.3.16
C2 · 试验介质/溶液硝酸盐培养基 · pH
7.1 ~ 7.5成分溶解后出处：10.2.3.16
C2 · 试验介质/溶液基础培养基 · pH
7.4 ~ 7.6 pH制备基础培养基时出处：10.2.3.16
C3 · 样品状态调节强制沉淀 · 室温放置温度
15 ~ 22 ℃使用前将沉淀置室温中直至结晶溶解出处：7.3.3.2
C3 · 样品状态调节强制水源水样本 · 前期处理
具有高藻、高有机质和高絮凝剂含量的水源水样本应先进行前期处理。具有高藻、高有机质和高絮凝剂含量的水源水样本出处：8.1.5.2
C4 · 样品采集/保存培养基 · 冷藏保存温度
0 ~ 4 ℃灭菌后保存出处：1
C4 · 样品采集/保存培养基 · 保存温度
2 ~ 8 ℃制备好的培养基保存备用出处：4.1.3.8
C4 · 样品采集/保存培养基 · 保存温度
0 ~ 4 ℃冷藏避光保存出处：4.2.3.11
C4 · 样品采集/保存培养基 · 冷藏保存温度
0 ~ 4 ℃灭菌后保存出处：5.1.3.10
C4 · 样品采集/保存推荐培养基 · 冷藏保存期限
≤ 2 周0 ℃～4 ℃冷藏保存出处：5.1.3.10
C4 · 样品采集/保存允许水样 · 采样体积
20±None L水源水出处：7.3.3.2
C4 · 样品采集/保存允许滤囊 · 冷藏避光保存时间
≤ 72 h过滤后于0℃~4℃冷藏避光保存出处：7.3.3.2
C4 · 样品采集/保存滤芯 · 冷藏避光保存时间
≤ 72 h过滤后于0℃~4℃冷藏避光保存出处：7.3.3.2
C4 · 样品采集/保存滤囊 · 冷藏避光保存时间
≤ 72 h过滤后于0℃~4℃冷藏避光保存出处：7.3.3.2
C4 · 样品采集/保存推荐水样采集体积 · 采集体积
根据水样类型不同,采集不同体积水样:水源水宜采集 10 L,生活饮用水宜采集 50 L。水源水宜采集10 L，生活饮用水宜采集50 L出处：8.2.4.1
C4 · 样品采集/保存允许水样 · 保存温度与处理时限
1 ~ 10 ℃样品采集后若不能立即处理，72 h内进行浓缩处理出处：8.2.4.1
C4 · 样品采集/保存培养基 · 冷藏保存温度
0 ~ 4 ℃当天不用时出处：10.2.3.16
C5 · 设备能力要求培养盘 · 孔槽数与每孔容量
含有 84 个孔槽, 每个孔槽容纳 0.06 mL 待测水样定量培养用无菌塑料盘出处：4.2.3.8
C5 · 设备能力要求培养盘孔槽 · 每孔容量
0.06±None mL定量培养用无菌塑料盘出处：4.2.3.8
C5 · 设备能力要求允许定量盘 · 孔穴数与每孔容量
含 51 个孔穴, 每一孔穴可容纳 2 mL 水样定量培养用无菌塑料盘出处：5.3.3.6
C5 · 设备能力要求蠕动泵 · 流量
2±None L/min出处：7.3.3.2
C5 · 设备能力要求允许流量控制阀 · 压力
0.21±None MPa对于处理水可任意选择出处：7.3.3.2
C5 · 设备能力要求流量控制阀 · 流量范围
1 ~ 4 L/min出处：7.3.3.2
C5 · 设备能力要求水平振荡器 · 最大频率
≤ 600 r/min有臂的水平振荡装置，臂上有垂直安装的过滤夹出处：7.3.3.2
C5 · 设备能力要求离心机 · 离心力
1500±None g出处：7.3.3.2
C5 · 设备能力要求滤膜 · 孔径
3.0±None μm直径 73 mm出处：7.3.3.2
C5 · 设备能力要求允许空气压缩机 · 压力
≥ 0.5 MPa可压缩 15 L 空气出处：7.3.3.2
C5 · 设备能力要求离心机 · 离心力
2000±None g出处：7.3.3.2
C6 · 精密度/质控限强制检验批 · 平行接种与空白对照
每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照每次检验时出处：4.1.3.8
C6 · 精密度/质控限强制平皿 · 片状菌落生长时数据处理
若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长出处：4.1.3.8
C6 · 精密度/质控限强制培养基 · 阳性对照
每新购或新配制一批培养基，都应做阳性对照每新购或新配制一批培养基出处：4.2.3.11
C6 · 精密度/质控限强制计数结果 · 生长率
≥ 0.7与标样标准值相比出处：4.2.3.11
C6 · 精密度/质控限强制培养基 · 阴性对照
每新购或新配制一批培养基，都应做阴性对照，用 1 mL 无菌水代替实际水样每新购或新配制一批培养基出处：4.2.3.11
C6 · 精密度/质控限强制免疫荧光试剂盒 · 质量控制频次
免疫荧光试剂盒的质量控制应每批次试验做一次，由阳性对照和阴性对照组成。每批次试验做一次，由阳性对照和阴性对照组成出处：8.1.5.2
C6 · 精密度/质控限强制阴性对照 · 计数结果
d) 对整个染色区域进行计数,不应找出任何贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫的卵囊。对整个染色区域进行计数出处：8.1.5.2
C6 · 精密度/质控限强制阳性对照 · 计数结果
e) 对整个染色区域进行计数,应找到表 7 中描述的规则而均匀的染色孢囊和卵囊。对整个染色区域进行计数出处：8.1.5.2
C6 · 精密度/质控限强制整个步骤 · 质量控制频次
整个步骤(从采样到显微镜检查)的质量控制应每三个月做一次。从采样到显微镜检查，每三个月做一次出处：8.1.5.2
C6 · 精密度/质控限质量控制试验 · 阳性/阴性对照体积
20±None L由两个试验组成：20L加有原虫的水作为阳性对照，20L纯水作为阴性对照出处：8.1.5.2
C6 · 精密度/质控限允许原虫接种液浓度读数 · 标准差
≤ 25 %标准差小于25%时读数视为正确出处：8.1.5.2
C6 · 精密度/质控限原虫接种液浓度读数 · 标准差
≥ 25 %标准差大于25%时需重新制备接种液出处：8.1.5.2
C6 · 精密度/质控限回收率 · 回收率
10 ~ 100 %回收率在10%~100%之间符合质量控制要求出处：8.1.5.2
C6 · 精密度/质控限强制空白试验 · 贾第鞭毛虫孢囊检出
≤ 0 个取 50 μL PBS 作为样品出处：8.2.5.1
C6 · 精密度/质控限阳性对照 · 孢囊外形完好率
≥ 50 %取 10 μL 阳性控制样品直接染色出处：8.2.5.1
C6 · 精密度/质控限允许空白试验 · 孢囊检出
≤ 0 个用 10 L 纯水作为空白出处：8.2.5.1
C6 · 精密度/质控限方法回收率 · 回收率
20 ~ 100 %出处：8.2.5.1
C6 · 精密度/质控限阳性菌株 · 接种浓度
10 ~ 100 CFU/mL肠球菌肉汤阳性菌株出处：1
C6 · 精密度/质控限阴性菌株 · 接种浓度
1000 ~ 5000 CFU/mL阴性菌株出处：1
C6 · 精密度/质控限强制阳性菌株 · 黑色沉淀
阳性菌株经肠球菌肉汤培养液培养后应产生黑色沉淀阳性菌株经肠球菌肉汤培养液培养后出处：1
C6 · 精密度/质控限强制阴性菌株 · 黑色沉淀
阴性菌株不应产生黑色沉淀阴性菌株经肠球菌肉汤培养液培养后出处：1
C6 · 精密度/质控限阳性/阴性菌株菌悬液 · 菌悬液浓度
100 ~ 1000 CFU/100 mL阳性菌株粪肠球菌和阴性菌株大肠埃希氏菌出处：1
C6 · 精密度/质控限强制阴性对照 · 黑色沉淀
阴性对照试验的肠球菌肉汤培养基中不应产生黑色沉淀阴性对照试验的肠球菌肉汤培养基出处：1
C6 · 精密度/质控限强制阳性对照 · 黑色沉淀
阳性对照试验的肠球菌肉汤培养基中应产生黑色沉淀阳性对照试验的肠球菌肉汤培养基出处：1
C6 · 精密度/质控限强制对照试验 · 结果有效性
如阴性对照或阳性对照试验结果不符合，本批次试验结果无效，应查明原因后重新测定阴性对照或阳性对照试验结果不符合出处：1
C6 · 精密度/质控限强制阳性菌株 · 培养后菌落颜色
阳性菌株经过滤在CATA琼脂平板培养后应产生红色小菌落；阳性菌株验收出处：10.2.3.16
C6 · 精密度/质控限强制阴性菌株 · 培养后菌落颜色
阴性菌株不应产生红色小菌落。阴性菌株验收出处：10.2.3.16
C6 · 精密度/质控限强制肠球菌培养基 · 验收方式
针对具有选择性作用的肠球菌肉汤和肠球菌琼脂培养基，应采用阳性及阴性菌株进行验收；选择性培养基验收出处：10.2.3.16
C6 · 精密度/质控限菌悬液 · 菌悬液浓度
10 ~ 100 CFU/100 mL阳性及阴性菌株验收出处：10.2.3.16
C6 · 精密度/质控限强制阴性对照试验 · 菌落颜色
阴性对照试验不应产生红色小菌落；阴性对照出处：10.2.3.16
C6 · 精密度/质控限强制阳性对照试验 · 菌落颜色
阳性对照试验应产生红色小菌落，再经过10.1.4.3确认检出肠球菌。阳性对照出处：10.2.3.16
C6 · 精密度/质控限空白对照 · 空白对照体积
100±None mL每次试验出处：11.1.4.2
C6 · 精密度/质控限暴烈发酵现象 · 观察时限
≤ 5 h暴烈发酵观察出处：11.1.4.2
C6 · 精密度/质控限硝酸盐还原试验 · 显色观察时限
≤ 15 min硝酸盐还原为亚硝酸盐判定出处：11.1.4.2
C6 · 精密度/质控限阳性和阴性菌株检验 · 菌悬液浓度
5 ~ 100 CFU/100 mL更换不同批次培养基时进行阳性和阴性菌株检验出处：11.1.4.2
C6 · 精密度/质控限强制阳性菌株 · 菌落颜色
阳性菌株应产生黑色菌落；阳性菌株检验出处：11.1.4.2
C6 · 精密度/质控限强制阴性菌株 · 菌落颜色
阴性菌株不应产生黑色菌落。阴性菌株检验出处：11.1.4.2
C6 · 精密度/质控限阳性和阴性菌株 · 菌悬液浓度
5 ~ 100 CFU/100 mL阳性菌株和阴性菌株制成菌悬液出处：11.1.4.2
C6 · 精密度/质控限强制阴性对照试验 · 菌落颜色
阴性对照试验不应出现黑色菌落；阴性对照试验出处：11.1.4.2
C6 · 精密度/质控限强制阳性对照试验 · 菌落颜色
阳性对照试验应产生黑色菌落，再经过11.1.5.6确认检出产气荚膜梭状芽孢杆菌。阳性对照试验出处：11.1.4.2
C7 · 分级/条件限值平均菌落数 · 计数有效范围
30 ~ 300 CFU选择平均菌落数进行计算出处：4.1.3.8
C7 · 分级/条件限值强制两个稀释度菌落数比值 · 报告规则判定阈值
≤ 2两个稀释度生长的菌落数均在 30～300 之间出处：4.1.3.8
C7 · 分级/条件限值强制平均菌落数 · 报告规则
≥ 300 CFU所有稀释度的平均菌落数均大于 300出处：4.1.3.8
C7 · 分级/条件限值强制平均菌落数 · 报告规则
≤ 30 CFU所有稀释度的平均菌落数均小于 30出处：4.1.3.8
C7 · 分级/条件限值强制平均菌落数 · 报告规则
应以最接近 30 或 300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告结果所有稀释度的平均菌落数均不在 30～300 之间出处：4.1.3.8
C7 · 分级/条件限值稀释度选择 · 菌落总数范围
≤ 738 MPN/mL只有一个稀释度结果符合此范围出处：4.2.3.11
C7 · 分级/条件限值稀释度选择 · 菌落总数范围
≤ 738 MPN/mL两个或两个以上稀释度结果均落在范围内出处：4.2.3.11
C7 · 分级/条件限值允许接种方式 · 接种量
对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接接种 5 份 10 mL 水样双料培养基已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次出处：5.1.3.10
C7 · 分级/条件限值强制接种 · 稀释度
检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种 1 mL、0.1 mL、0.01 mL，甚至 0.1 mL、0.01 mL、0.001 mL检验水源水时，如污染较严重出处：5.1.3.10
C7 · 分级/条件限值离心管 · 总体积
10±None mL压实的沉淀物体积小于或等于0.5mL时出处：7.3.3.2
C7 · 分级/条件限值离心管 · 总体积
d) 如果压实的沉淀物体积大于 0.5 mL, 用公式(3)确定在离心管中需要的总体积:压实的沉淀物体积大于0.5mL时出处：7.3.3.2
C7 · 分级/条件限值试管 · 旋转式搅拌器时间
20±None s压实的沉淀物体积小于或等于0.5mL时出处：7.3.3.2
C7 · 分级/条件限值离心管 · 总体积
d) 如果压实的沉淀物体积大于 0.5 mL，用公式(4)确定在离心管中需要的总体积，以便将再悬浮的沉淀物调整到相当于 0.5 mL 压实沉淀物的体积。压实的沉淀物体积大于0.5mL时出处：7.3.3.2
C7 · 分级/条件限值沉淀物 · PBST加入量
≤ 2 mL沉淀物总体积V小于或等于2 mL时，各加入2.5 mL PBST出处：8.2.4.1
C7 · 分级/条件限值沉淀物 · PBST加入量
≥ 2 mL沉淀物总体积V大于2 mL时，各加入1.25倍V的PBST出处：8.2.4.1
C7 · 分级/条件限值沉淀物重悬 · PBST加入体积
若沉淀物总体积 V 小于或等于 2 mL，向上述浓缩后的沉淀物中各加入 2.5 mL 的 PBST沉淀物总体积 V ≤ 2 mL出处：8.2.4.1
C7 · 分级/条件限值沉淀物重悬 · PBST加入体积
若沉淀物总体积 V 大于 2 mL，需各加入的 PBST 体积为 1.25 倍的 V沉淀物总体积 V > 2 mL出处：8.2.4.1
C7 · 分级/条件限值水样处理流程 · 重复步骤与重悬方式选择
水样量大于 10 L 时，根据水样体积重复步骤 8.2.4.2.2.1～8.2.4.2.2.4水样量大于 10 L出处：8.2.4.1
C7 · 分级/条件限值允许双料浓度肠球菌肉汤 · 纯水用量
若制备双料浓度的肠球菌肉汤，可将上述配方中纯水改为 500 mL制备双料浓度时出处：9.2.2.3
C7 · 分级/条件限值强制水样接种 · 稀释度与接种管数
当生活饮用水可能处于较为严重的污染时，应加大稀释度，可接种 1 mL、0.1 mL、0.01 mL 或 0.1 mL、0.01 mL、0.001 mL，每个稀释度接种 3 管，每个水样共接种 9 管生活饮用水可能处于较为严重的污染时出处：10.1.3.14
C7 · 分级/条件限值强制MPN表 · 接种量换算
表内所列接种量如改用1 mL、0.1 mL和0.01 mL时,则表内数字应相应增高10倍表内所列接种量如改用1mL、0.1mL和0.01mL时出处：1
C8 · 适用范围与限制菌落计数结果 · 未检出报告规则
若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则以未检出报告结果所有稀释度的平板上均无菌落生长出处：4.1.3.8
C8 · 适用范围与限制强制菌落计数结果 · 菌落密布报告规则
应在稀释度最大的平板上，任意计数其中2个平板 1 cm^{2} 中的菌落数，除2求出每平方厘米内平均菌落数，乘以皿底面积 63.6 cm^{2}所有平板上都菌落密布出处：4.1.3.8
C8 · 适用范围与限制菌落计数报告 · 有效数字与修约规则
菌落数在 100 以内时按实有数报告，大于 100 时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算菌落数在 100 以内时按实有数报告，大于 100 时采用两位有效数字出处：4.1.3.8
C8 · 适用范围与限制未稀释水样 · 检测范围
≤ 738 MPN/mL本方法未稀释水样出处：4.1.3.8
C8 · 适用范围与限制强制结果报告 · 稀释倍数修正
如果样品进行了稀释,读取的结果应乘以稀释倍数并报告之,结果以 MPN/mL 表示样品进行了稀释出处：4.2.3.11
C8 · 适用范围与限制允许结果报告 · 未检出报告
如果所有孔均未显荧光,则可报告为菌落总数未检出所有孔均未显荧光出处：4.2.3.11
C8 · 适用范围与限制结果报告 · 未检出报告
若所有稀释度的培养盘上均无蓝色荧光，则以未检出报告结果所有稀释度培养盘均无蓝色荧光出处：4.2.3.11
C8 · 适用范围与限制强制结果报告 · 稀释倍数修正
稀释样品查表后所得结果应乘稀释倍数稀释样品查表后出处：5.1.3.10
C8 · 适用范围与限制允许结果报告 · 未检出报告
如所有乳糖发酵管均为阴性时,可报告总大肠菌群未检出所有乳糖发酵管均为阴性出处：5.1.3.10
C8 · 适用范围与限制结果报告 · 总大肠菌群数报告单位
以每 100 mL 水样中的总大肠菌群菌落数 (CFU/100 mL) 报告结果滤膜法结果报告出处：5.2.5.2
C8 · 适用范围与限制允许结果判读 · 培养时间与判读时限
如果结果为可疑阳性, 可延长培养时间到 28 h 进行结果判读, 超过 28 h 之后出现的颜色反应不作为阳性结果可疑阳性可延长培养至28 h，超过28 h颜色反应不作为阳性出处：5.3.3.8
C8 · 适用范围与限制结果报告 · 定性反应报告方式
定性反应结果以总大肠菌群检出或未检出报告定性反应结果出处：5.3.3.8
C8 · 适用范围与限制结果报告 · MPN结果表示单位
结果以 MPN/100 mL 表示MPN法结果出处：5.3.3.8
C8 · 适用范围与限制允许结果报告 · 未检出报告方式
如所有管均未产生黄色，则可报告为总大肠菌群未检出所有管均未产生黄色出处：5.3.3.8
C8 · 适用范围与限制允许结果报告 · 未检出报告方式
如所有孔均未产生黄色，则可报告为总大肠菌群未检出所有孔均未产生黄色出处：5.3.3.8
C8 · 适用范围与限制结果报告 · MPN报告方式
对照 MPN 表,报告每 100 mL 水样中耐热大肠菌群的 MPN 值根据证实为耐热大肠菌群阳性的管数出处：6.1.4.2
C8 · 适用范围与限制结果报告 · 菌落数报告方式
以每 100 mL 水样中的耐热大肠菌群菌落数 (CFU/100 mL) 报告结果按公式(2)计算滤膜上生长的耐热大肠菌群数出处：6.2.4.4
C8 · 适用范围与限制结果报告 · MPN报告方式
查对应的 MPN 表得出大肠埃希氏菌的 MPN 值, 结果以 MPN/100 mL 报告计算EC-MUG阳性的管数出处：7.1.4.2
C8 · 适用范围与限制结果判读 · 阳性判定
在暗处用波长为 366 nm 的紫外灯照射，如果有蓝色荧光产生判断为阳性经过24h培养颜色变成黄色的水样，暗处366nm紫外灯照射有蓝色荧光出处：7.3.3.2
C8 · 适用范围与限制结果报告 · 报告方式
结果以大肠埃希氏菌检出或未检出报告大肠埃希氏菌检测出处：7.3.3.2
C8 · 适用范围与限制结果判读 · 阳性判定
在暗处用波长为 366~nm 的紫外灯照射，如果有蓝色荧光产生，则表示大肠埃希氏菌为阳性培养24h水样颜色变成黄色的试管，暗处366nm紫外灯照射有蓝色荧光出处：7.3.3.2
C8 · 适用范围与限制结果报告 · MPN查表
计算有荧光反应的试管数，对照表 5 查出其代表的大肠埃希氏菌 MPN 值计算有荧光反应的试管数出处：7.3.3.2
C8 · 适用范围与限制允许结果报告 · 未检出报告
如所有管均未产生荧光，则可报告大肠埃希氏菌未检出如所有管均未产生荧光出处：7.3.3.2
C8 · 适用范围与限制结果判读 · 阳性判定
在暗处用波长为 366 nm 的紫外灯照射, 如果有蓝色荧光产生, 则表示该定量盘孔穴中大肠埃希氏菌为阳性培养24h颜色变成黄色的水样的定量盘，暗处366nm紫外灯照射有蓝色荧光出处：7.3.3.2
C8 · 适用范围与限制结果报告 · MPN查表
计算有荧光反应的孔穴数，对照表6查出其代表的大肠埃希氏菌MPN值计算有荧光反应的孔穴数出处：7.3.3.2
C8 · 适用范围与限制肠球菌MPN结果 · 结果表示
对照表 8,报告每 100 mL 水样中的肠球菌 MPN 值,以 MPN/100 mL 表示根据证实为肠球菌阳性的管数出处：1
C8 · 适用范围与限制强制肠球菌计数 · 选取滤膜的菌落数范围
20 ~ 60 个对证实为肠球菌菌落的滤膜进行计数出处：10.2.3.16
C8 · 适用范围与限制肠球菌数结果 · 结果报告单位
以每 100 mL 水样中的肠球菌数(CFU/100 mL)报告结果。结果报告出处：10.2.3.16
C8 · 适用范围与限制产气荚膜梭状芽孢杆菌菌落数 · 结果报告单位
结果以 CFU/100 mL 报告。结果计算与报告出处：11.1.4.2
C9 · 过程控制参数培养基 · 高压蒸汽灭菌
121±None ℃分装于玻璃容器中出处：1
C9 · 过程控制参数培养基 · 高压蒸汽灭菌时间
20±None min121 ℃高压蒸汽灭菌出处：1
C9 · 过程控制参数水样 · 取样体积
1±None mL以无菌操作方法用无菌吸管或移液器吸取充分混匀的水样出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数营养琼脂培养基 · 倾注体积
15±None mL已融化并冷却到 45 ℃ 左右出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数平皿 · 培养温度
36±1 ℃待冷却凝固后翻转平皿置于培养箱内出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数平皿 · 培养时间
48±2 h36 ℃±1 ℃ 培养箱内培养出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数水样 · 取样体积
1±None mL以无菌操作方法用无菌吸管或移液器吸取充分混匀的水样出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数无菌生理盐水 · 体积
9±None mL制备 1:10 稀释液出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数稀释液 · 取样体积
1±None mL用无菌吸管或移液器吸取 1:10 的稀释液出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数无菌生理盐水 · 体积
9±None mL制备 1:100 稀释液出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数强制无菌吸管或吸头 · 更换频次
每稀释一个稀释度，应更换一次 1 mL 无菌吸管或吸头每稀释一个稀释度出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数水样 · 稀释度个数
2 ~ 3 个适宜稀释度的水样出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数水样 · 取样体积
1±None mL每个适宜稀释度出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数强制菌落计数 · 同稀释度平均菌落数计算
在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数记下各平皿的菌落数后出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数平皿 · 皿底面积
63.6±None cm²菌落密布时计算出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数培养盘 · 培养温度
36±1 ℃使用基于复合酶底物技术的培养基出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数培养盘 · 培养时间
48±None h使用基于复合酶底物技术的培养基出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数4-甲基伞形酮 · 荧光激发波长
366±None nm紫外灯照射下观察蓝色荧光出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数培养基 · 过滤除菌滤膜孔径
0.22±None μm调整 pH 后出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数生理盐水 · 高压蒸汽灭菌
121±None ℃充分溶解后出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数生理盐水 · 高压蒸汽灭菌时间
20±None min121 ℃高压蒸汽灭菌出处：4.1.3.8
C9 · 过程控制参数水样 · 检测所需水样体积
1±None mL检测所需水样出处：4.2.3.11
C9 · 过程控制参数水样 · 取样体积
1±None mL以无菌操作方法用无菌吸管或移液器吸取充分混匀的水样出处：4.2.3.11
C9 · 过程控制参数无菌生理盐水 · 体积
9±None mL制备稀释液出处：4.2.3.11
C9 · 过程控制参数稀释液 · 取样体积
1±None mL充分振荡混匀后取 1 mL 进行检测出处：4.2.3.11
C9 · 过程控制参数允许稀释液 · 稀释倍数
必要时可加大稀释度，以 10 倍逐级稀释必要时可加大稀释度出处：4.2.3.11
C9 · 过程控制参数液体培养基 · 加入体积
9±None mL向一无菌试管中加入制备好的液体培养基出处：4.2.3.11
C9 · 过程控制参数成品培养基 · 培养基质量
0.1±None g如选用符合要求的成品培养基出处：4.2.3.11
C9 · 过程控制参数无菌生理盐水 · 加入体积
9±None mL如选用符合要求的成品培养基出处：4.2.3.11
C9 · 过程控制参数培养 · 培养时间
48±None h36℃±1℃培养箱出处：4.2.3.11
C9 · 过程控制参数推荐培养盘 · 叠放层数
≤ 10 层可叠放培养出处：4.2.3.11
C9 · 过程控制参数涂片 · 结晶紫染色时间
1±None min滴加结晶紫染色液出处：4.2.3.11
C9 · 过程控制参数涂片 · 革兰氏碘液作用时间
1±None min滴加革兰氏碘液出处：4.2.3.11
C9 · 过程控制参数涂片 · 脱色时间
30±None s滴加脱色剂摇动玻片至无紫色脱落出处：4.2.3.11
C9 · 过程控制参数涂片 · 沙黄复染时间
1±None min加沙黄复染液出处：4.2.3.11
C9 · 过程控制参数接种 · 接种量
吸取 10 mL 水样接种到 10 mL 双料乳糖蛋白胨培养液中，取 1 mL 水样接种到 10 mL 单料乳糖蛋白胨培养液中水样接种出处：5.1.3.10
C9 · 过程控制参数强制接种 · 稀释操作
接种 1 mL 以下水样时，应作 10 倍递增稀释后，取 1 mL 接种，每递增稀释一次，换用 1 支 1 mL 无菌吸管接种 1 mL 以下水样出处：5.1.3.10
C9 · 过程控制参数培养 · 培养时间
24±2 h36℃±1℃培养箱出处：5.1.3.10
C9 · 过程控制参数培养基 · 高压蒸汽灭菌温度与时间
经 115 ℃ 高压蒸汽灭菌 20 min 后分装后出处：5.1.3.10
C9 · 过程控制参数亚硫酸钠溶液 · 沸水浴煮沸时间
10±None min溶解后灭菌出处：5.1.3.10
C9 · 过程控制参数培养基 · 倾入平皿体积
15±None mL混匀后立即倾入无菌空平皿出处：5.1.3.10
C9 · 过程控制参数滤膜 · 沸水浴煮沸灭菌次数与每次时间
置于沸水浴中煮沸灭菌 3 次, 每次 15 min滤膜灭菌出处：5.2.3.4
C9 · 过程控制参数允许滤膜 · 高压蒸汽灭菌温度与时间
也可用高压蒸汽灭菌器 121^{\circ} C 高压蒸汽灭菌 20 min可用高压蒸汽灭菌器替代出处：5.2.3.4
C9 · 过程控制参数允许水样 · 过滤水样体积
100±None mL水样含菌数较多时可减少过滤水样量或稀释出处：5.2.3.4
C9 · 过程控制参数抽滤 · 抽滤压力
-50700±None Pa打开滤器阀门抽滤出处：5.2.3.4
C9 · 过程控制参数抽滤 · 过滤完后抽气时间
5±None s过滤完水样后出处：5.2.3.4
C9 · 过程控制参数培养 · 培养时间
24±2 h36℃±1℃恒温箱内出处：5.2.3.4
C9 · 过程控制参数乳糖蛋白胨培养液接种 · 培养温度与时间
于 36^{\circ}C ± 1^{\circ}C 培养 24 h ± 2 h革兰氏染色阴性的无芽孢杆菌再接种出处：5.2.5.1
C9 · 过程控制参数MMO-MUG培养基 · 分装体积与灭菌条件
溶解后,分装到稀释瓶内,每瓶 90 mL,121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min溶解后分装到稀释瓶出处：5.2.5.3
C9 · 过程控制参数水样 · 检测所需水样体积
100±None mL检测所需水样出处：5.3.3.8
C9 · 过程控制参数允许水样 · 稀释比例
若水样污染严重，可对水样进行稀释，取 10 mL 水样加入到 90 mL 无菌生理盐水中水样污染严重时出处：5.3.3.8
C9 · 过程控制参数水样 · 培养基加入量与培养条件
加入 2.7 g MMO-MUG 培养基粉末，混合均匀使之完全溶解后，放入 36^{\circ}C ± 1^{\circ}C 的培养箱内培养 24 h100 mL水样加2.7 g MMO-MUG培养基粉末出处：5.3.3.8
C9 · 过程控制参数水样 · 分装体积与培养条件
用无菌吸管分别从前述稀释瓶中取 10 mL 水样至各试管中，放入 36^{\circ} C ±1℃ 的培养箱中培养 24 h10支无菌试管各取10 mL水样出处：5.3.3.8
C9 · 过程控制参数水样 · 定量盘封口操作
将前述 100 mL 水样全部倒入 51 孔无菌定量盘内，以手抚平定量盘背面，去除孔穴内气泡，然后用程控定量封口机封口100 mL水样倒入51孔定量盘出处：5.3.3.8
C9 · 过程控制参数强制培养 · 培养温度与时间
水浴箱的水面应高于试管中培养基液面，培养 24水浴箱水面应高于试管中培养基液面出处：6.1.4.1
C9 · 过程控制参数允许培养后转种 · 产气判定与转种
如所有管均不产气，则可报告为未检出，如有产气者，则转种于伊红美蓝琼脂平板上如所有管均不产气则报告未检出；如有产气者转种伊红美蓝琼脂平板出处：6.1.4.1
C9 · 过程控制参数滤膜过滤培养 · 滤膜孔径与培养条件
用孔径为 0.45 μm 的滤膜过滤水样，44.5℃培养 24 h 能形成特征性菌落用孔径0.45μm滤膜过滤水样，44.5℃培养24h出处：6.1.4.2
C9 · 过程控制参数培养 · 培养温度与时间
44.5±0.5 ℃过滤完水样后抽气约5s，滤膜贴紧培养基无气泡，平皿倒置培养出处：6.2.4.2
C9 · 过程控制参数培养 · 培养温度与时间
36±1 ℃将已接种的NA-MUG平板培养4h出处：7.2.4.1
C9 · 过程控制参数强制玻璃器皿和塑料器皿 · 消毒时机
所有玻璃器皿和塑料器皿都应在使用后及洗涤前经高压消毒。使用后及洗涤前出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数器材 · 次氯酸钠溶液浓度及浸泡时间
≥ 50.0 g/L用热浓洗涤剂溶液清洁器材后，至少在室温浸泡 30 min出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数蠕动泵流量 · 流量
2±None L/min生活饮用水采集过滤出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数滤囊外腔 · 淘洗液A加入量
110±None mL取下滤囊进水口乙烯帽后出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数样本 · 振荡时间
10±None min打开振荡器开关后出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数振荡器 · 功率与摇动时间
80±None %在80%功率下再摇10min出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数锥形离心管 · 离心力与离心时间
1500±None g装有淘洗液样本的锥形离心管离心15min出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数滤芯 · 顶部施加压力
0.05±None MPa为使液体流经滤芯出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数推荐液体流速 · 流速
3 ~ 4 L/min推荐的0.05MPa工作压力下出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数工作压力 · 最大工作压力
≤ 0.8 MPa工作压力出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数浓缩管 · 淘洗液B加入量
600±None mL浓缩管中重新加入淘洗液B出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数滤膜 · 淘洗液B加入量
5±None mL将3μm滤膜转移到袋子中后出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数浓缩管 · 淘洗液B注入量
600±None mL向浓缩管注入淘洗液B出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数离心瓶 · 离心力与离心时间
2000±None g装有淘洗液样本的离心瓶离心15min出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数强制离心瓶 · 保留液体体积与吸气装置压力
8 ~ 10 mL离心后用吸气装置吸出上层悬浮液体，吸气装置压力应小于3.3kPa出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数离心瓶 · 纯水冲洗量
1±None mL用纯水冲洗离心瓶二次出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数Leighton管 · 缓冲液A和B加入量
1±None mL加1mL缓冲液A和1mL缓冲液B到Leighton管中出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数Leighton管 · 水样浓缩物转移量
10±None mL定量转移水样浓缩物到Leighton管中出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数旋转式搅拌器 · 转速与旋转时间
25±None r/min将含有样品的Leighton管固定到旋转式搅拌器上旋转1h出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数倾斜操作 · 倾斜频率与持续时间
1±None 次/s以每秒大约倾斜一次的频率持续2min出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数磁粒浓缩器1中的样品 · 静置时间
≤ 10 s如果磁粒浓缩器1中的样品静置10s以上，就要重复步骤8.1.4.2.8出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数试管 · 缓冲液A加入量
1±None mL将试管从磁粒浓缩器1上取下后加缓冲液A出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数摇动操作 · 摇动角度与持续时间
180±None °每秒大约摇动一个180°角，持续大约1min出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数微量离心管 · 盐酸加入量与涡旋时间
50±None μL加50μL 0.1mol/L盐酸至微量离心管中，涡旋混合10s出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数试管 · 室温垂直静置时间
10±None min将试管放在磁粒浓缩器2上室温垂直静置出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数试管 · 涡旋时间
5 ~ 10 s用力涡旋出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数试管 · 倾斜频率与持续时间
1±None 次/s使试管盖顶和基底轮流上下倾斜，以每秒大约倾斜一次的频率持续30s出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数载玻片 · 干燥温度与时间
≤ 2 h将有样品的载玻片置37℃培养箱中干燥不超过2h，或置室温避光自然风干出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数载玻片 · 纯甲醇加入量与自然干燥时间
3 ~ 5 min加一滴(50μL)纯甲醇后自然干燥出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数载玻片 · 培养温度与时间
36±1 ℃将载玻片放到湿盒中培养30min左右出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数玻片 · PBS加入量与静置时间
1 ~ 2 min加70μL PBS后静置出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数玻片 · DAPI溶液加入量与静置时间
50±None μL加50μL DAPI溶液到玻片上，室温静置2min左右出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数玻片 · PBS加入量与静置时间
1 ~ 2 min加70μL PBS后静置出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数玻片 · 纯水加入量与静置时间
70±None μL加70μL纯水到玻片上，静置1min后吸掉多余纯水出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数荧光显微镜 · 预热时间与放大倍数
15±None min预热15min后在200倍荧光显微镜下检查，再依次在400倍蓝光激发、400倍紫外激发下证实出处：7.3.3.2
C9 · 过程控制参数阳性对照样品 · 涡旋时间
2±None min将阳性对照样品涡旋以混匀储存的原虫孢(卵)囊出处：8.1.5.2
C9 · 过程控制参数允许过滤操作 · 流速
≥ 0.3 L/min过滤压力过大(流速低于0.3 L/min)时可更换新滤膜重复步骤出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数推荐蠕动泵 · 转速与水样流速
300 ~ 600 r/min推荐转速300 r/min～600 r/min，对应水样流速0.3 L/min～2 L/min出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数离心操作 · 离心力与时间
1050±None g离心10 min，勿用制动器，减速度为0出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数离心操作 · 离心力、温度与时间
1050±None g20 ℃条件下离心10 min，勿用制动器，减速度为0出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数离心操作 · 离心力、温度与时间
2000±None g20 ℃条件下离心10 min，勿用制动器，减速度为0出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数沉淀物总体积 · 沉淀物总体积V
记录 4 个 15 mL 离心管中沉淀物的总体积为 V。记录4个15 mL离心管中沉淀物的总体积为V出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数离心管样品 · 样品体积
≤ 3 mL分装至多个15 mL离心管，保证每个离心管内样品体积不超过3 mL出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数水样 · pH与静置时间
10±None用氢氧化钠溶液调节pH至10，静置12 h～16 h后吸去上清液出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数离心操作 · 离心力、温度与时间
2000±None g20 ℃条件下离心10 min，勿用制动器，减速度为0出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数离心操作 · 离心力/温度/时间/减速度
在 2000 g、20℃ 条件下离心 10 min（勿用制动器，减速度为 0）2000 g、20℃出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数离心操作 · 离心力/温度/时间/减速度
在 2000 g、20℃ 条件下离心 10 min（勿用制动器，减速度为 0）2000 g、20℃出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数Percoll-蔗糖溶液加入 · 加入体积与操作方式
从溶液底部缓慢加入 5 mL Percoll-蔗糖溶液，加入过程中避免搅混两种溶液出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数离心操作 · 离心力/温度/时间/减速度
在 1050 g、20 ℃ 条件下离心 10 min（勿用制动器，减速度为 0）1050 g、20 ℃出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数中间层吸取 · 吸取位置
用塑料吸管取中间层（从中间层上部吸取）富含孢囊的混合液出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数沉淀物重悬 · PBST加入体积
向离心后的沉淀物中添加 2.5 mL 的 PBST，混匀出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数二次分离纯化 · Percoll-蔗糖溶液加入体积
再次从溶液底部缓慢加入 5 mL Percoll-蔗糖溶液按照上述步骤进行二次分离纯化出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数离心管淋洗 · PBS淋洗体积
用 3 mL PBS 淋洗 15 mL 离心管，淋洗液用上述方法抽滤出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数BSA溶液滴加 · 滴加体积与保持时间
在滤膜圆圈内滴加 0.50 mL BSA 溶液，保持 2 min，若圆圈内仍有明显液体残留则继续抽滤出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数载玻片静置 · 静置时间与条件
将载玻片置于潮湿暗环境中，在室温条件下避光静置 30 min室温、避光、潮湿暗环境出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数DAPI染色 · 滴加体积与静置时间
再向滤膜圆圈内滴加 0.10 mL DAPI 染色溶液，室温条件下避光静置 10 min室温、避光出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数滤膜淋洗 · PBS淋洗体积
在滤膜圆圈内滴加 4 mL PBS 进行淋洗出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数脱水剂滴加 · 脱水剂体积与顺序
依次向圆圈内滴加各 3 mL 的脱水剂 30、脱水剂 70 和脱水剂 90 进行抽滤出处：8.2.4.1
C9 · 过程控制参数原虫接种液制备 · 涡旋时间/搅拌时间/最终浓度
涡旋 2 min 存储的原虫，用磁棒搅拌 30 min，最终浓度大约每毫升 5×10^4 个孢囊通过稀释获得的原虫接种液出处：8.2.5.1
C9 · 过程控制参数阳性对照加标 · 加标量
100 ~ 500 个10 L 纯水样品出处：8.2.5.1
C9 · 过程控制参数肠球菌肉汤分装灭菌 · 分装体积/灭菌温度/灭菌时间
每管分装 10 mL，121 ℃ 高压蒸汽灭菌 15 min出处：9.2.2.3
C9 · 过程控制参数培养基 · 高压蒸汽灭菌温度
121±None ℃分装到试管中后出处：9.2.2.3
C9 · 过程控制参数培养基 · 高压蒸汽灭菌时间
15±None min121 ℃高压蒸汽灭菌出处：9.2.2.3
C9 · 过程控制参数培养基 · 高压蒸汽灭菌温度
121±None ℃调节pH后出处：9.2.2.3
C9 · 过程控制参数培养基 · 高压蒸汽灭菌时间
15±None min121 ℃高压蒸汽灭菌出处：9.2.2.3
C9 · 过程控制参数培养基 · 倾注平板温度
45 ~ 50 ℃灭菌后倾注平板备用出处：9.2.2.3
C9 · 过程控制参数水样接种 · 接种量
10±None mL接种到10mL双料肠球菌肉汤培养液出处：10.1.3.14
C9 · 过程控制参数水样接种 · 接种量
1±None mL接种到10mL单料肠球菌肉汤培养液出处：10.1.3.14
C9 · 过程控制参数水样稀释 · 稀释比例
1±None mL1mL水样注入9mL无菌生理盐水出处：10.1.3.14
C9 · 过程控制参数推荐稀释度选择 · 稀释度选择原则
宜选择包含阴性反应终点，即含有非 3 管全部发酵最低稀释度的 3 个连续稀释度选择包含阴性反应终点的连续稀释度出处：10.1.3.14
C9 · 过程控制参数强制水样稀释 · 稀释操作
接种 1 mL 以下水样时，应作 10 倍递增稀释后，取 1 mL 水样接种到 9 mL 无菌生理盐水中接种1mL以下水样时出处：10.1.3.14
C9 · 过程控制参数肠球菌肉汤管 · 培养温度
35±2 ℃置于培养箱内出处：1
C9 · 过程控制参数肠球菌肉汤管 · 培养时间
24±2 h35℃±2℃培养出处：1
C9 · 过程控制参数肠球菌琼脂平板 · 培养温度
35±2 ℃接种于肠球菌琼脂平板出处：1
C9 · 过程控制参数肠球菌琼脂平板 · 培养时间
24±2 h35℃±2℃培养出处：1
C9 · 过程控制参数BHIB肉汤 · 培养温度
35±0.5 ℃BHIB肉汤置培养出处：1
C9 · 过程控制参数BHIB肉汤 · 培养时间
24±2 h35℃±0.5℃培养出处：1
C9 · 过程控制参数BHIA平板 · 培养温度
35±0.5 ℃BHIA平板置培养出处：1
C9 · 过程控制参数BHIA平板 · 培养时间
48±2 h35℃±0.5℃培养出处：1
C9 · 过程控制参数BEA平板和6.5%氯化钠BHIB肉汤 · 培养温度
35±0.5 ℃置于培养出处：1
C9 · 过程控制参数BEA平板和6.5%氯化钠BHIB肉汤 · 培养时间
48±2 h35℃±0.5℃培养出处：1
C9 · 过程控制参数BHIB肉汤 · 培养温度
45±0.5 ℃BHIB肉汤置培养出处：1
C9 · 过程控制参数BHIB肉汤 · 培养时间
48±2 h45℃±0.5℃培养出处：1
C9 · 过程控制参数菌株接种 · 接种量
1±None mL阳性菌株和阴性菌株出处：1
C9 · 过程控制参数培养基 · 冷却温度
50±None ℃加热煮沸至溶解后冷却出处：1
C9 · 过程控制参数培养基 · TTC水溶液加入量
1±None mL每100mL中无菌加入1%TTC水溶液出处：1
C9 · 过程控制参数滤器 · 灭菌方式
滤器灭菌:用点燃的酒精棉球火焰灭菌,或 121℃ 高压蒸汽灭菌 20 min。滤器灭菌出处：10.2.3.16
C9 · 过程控制参数滤膜 · 煮沸灭菌次数与时间
滤膜灭菌: 将滤膜放入烧杯中, 加入纯水, 煮沸灭菌 3 次, 15 min/次, 前两次煮沸后需更换纯水洗涤 2 次～3 次。滤膜灭菌出处：10.2.3.16
C9 · 过程控制参数滤器抽滤 · 抽滤压力
-50700±None Pa水样过滤出处：10.2.3.16
C9 · 过程控制参数水样稀释 · 稀释比例
吸取水样25 mL到225 mL无菌生理盐水中，充分混匀，制成1∶10的稀释样品。制备1:10稀释样品出处：10.2.3.16
C9 · 过程控制参数稀释样品 · 稀释比例
再取25 mL的1∶10稀释样品加入225 mL无菌生理盐水中，充分混匀，制成1∶100的稀释样品。制备1:100稀释样品出处：10.2.3.16
C9 · 过程控制参数水样过滤 · 平行过滤数量与过滤体积
每个稀释度平行过滤2个水样，每个水样过滤100 mL。每个稀释度出处：10.2.3.16
C9 · 过程控制参数培养 · 培养温度与时间
35±2 ℃CATC琼脂平板培养出处：10.2.3.16
C9 · 过程控制参数强制证实试验 · 挑取菌落数
挑取 10 个典型菌落, 同时接种 BHIB 肉汤和 BHIA 平板, 之后证实试验应符合 10.1.4.3 的要求。肠球菌证实试验出处：10.2.3.16
C9 · 过程控制参数允许产气荚膜梭状芽孢杆菌培养 · 培养温度与时间
18 ~ 24 hSPS培养基厌氧培养出处：10.2.3.16
C9 · 过程控制参数培养基添加剂 · 加入比例
临用前每 250 mL 基础溶液按比例加入亚硫酸钠溶液（新配）、多黏菌素 B 硫酸盐溶液和磺胺嘧啶钠溶液，摇匀，倾注平板。临用前出处：10.2.3.16
C9 · 过程控制参数培养基 · 加热时间与冷却
临用前煮沸或流动蒸汽加热 15 min，迅速冷却至接种温度。临用前出处：10.2.3.16
C9 · 过程控制参数硫酸亚铁牛奶培养基 · 灭菌温度与时间
分装试管,每管 10 mL,118 ℃高压蒸汽灭菌 12 min。分装试管后出处：10.2.3.16
C9 · 过程控制参数基础溶液 · 保温温度
50±1 ℃高压蒸汽灭菌后保温备用出处：10.2.3.16
C9 · 过程控制参数滤膜 · 煮沸灭菌次数及时间
煮沸灭菌3次，15 min/次，前两次煮沸后需换水洗涤2次～3次。滤膜处理出处：11.1.4.2
C9 · 过程控制参数滤器 · 高压蒸汽灭菌条件
滤器经 121℃ 高压蒸汽灭菌 15 min。滤器灭菌出处：11.1.4.2
C9 · 过程控制参数水样抽滤 · 抽滤压力
-50700.0±None Pa100 mL水样注入滤器后抽滤出处：11.1.4.2
C9 · 过程控制参数厌氧培养 · 培养温度
36±1 ℃滤膜贴于SPS琼脂培养基后厌氧培养出处：11.1.4.2
C9 · 过程控制参数厌氧培养 · 培养时间
18 ~ 24 h滤膜贴于SPS琼脂培养基后厌氧培养出处：11.1.4.2
C9 · 过程控制参数强制可疑黑色菌落 · 挑取菌落数
从滤膜或培养基上挑取上述平板上生长的5个可疑黑色菌落（小于5个时应全部挑取）从平板上挑取可疑黑色菌落出处：11.1.4.2
C9 · 过程控制参数FT培养液接种 · 水浴培养温度
46±1 ℃接种于含铁牛乳培养基后水浴培养出处：11.1.4.2
C9 · 过程控制参数FT培养液接种 · 水浴培养时间
2±None h接种于含铁牛乳培养基后水浴培养出处：11.1.4.2
C9 · 过程控制参数缓冲动力-硝酸盐培养基 · 厌氧培养温度
36±1 ℃穿刺接种于缓冲动力-硝酸盐培养基后厌氧培养出处：11.1.4.2
C9 · 过程控制参数缓冲动力-硝酸盐培养基 · 厌氧培养时间
24±2 h穿刺接种于缓冲动力-硝酸盐培养基后厌氧培养出处：11.1.4.2
C9 · 过程控制参数亚硝酸盐检查 · 试剂加入量
滴加 0.5mL 甲液(对氨基苯磺酸液)和 0.2mL 乙液（α-萘酚乙酸溶液）以检查亚硝酸盐的存在。检查亚硝酸盐存在出处：11.1.4.2
C9 · 过程控制参数硝酸盐还原试验 · 加锌粉后放置时间
10±None min不出现颜色变化时加少许锌粉后放置出处：11.1.4.2
C9 · 过程控制参数卵黄琼脂平板 · 厌氧培养温度
36±1 ℃点种于卵黄琼脂平板后厌氧培养出处：11.1.4.2
C9 · 过程控制参数卵黄琼脂平板 · 厌氧培养时间
24±2 h点种于卵黄琼脂平板后厌氧培养出处：11.1.4.2
GB 4789.28食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求最新版适用规范性引用
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法最新版适用规范性引用
GB 19489实验室 生物安全通用要求最新版适用规范性引用
检测能力（方法标准）认可领域：02 化学 › 0235 水
序号检测对象项目/参数领域代码检测标准（方法）名称及编号（含年号）说明备注
序号名称
1生活饮用水1菌落总数023503《生活饮用水标准检验方法 第 12 部分: 微生物指标》GB/T5750.12-2023 4.2.5.1
Standard examination methods for drinking water—Part 12: Microbiological indices
22总大肠菌群023503《生活饮用水标准检验方法 第 12 部分: 微生物指标》GB/T5750.12-2023 5.1.5、5.3.5.3.2、5.3.5.4
Standard examination methods for drinking water—Part 12: Microbiological indices
33总大肠菌群菌落数023503《生活饮用水标准检验方法 第 12 部分: 微生物指标》GB/T5750.12-2023 5.2.5.3
Standard examination methods for drinking water—Part 12: Microbiological indices
44耐热大肠菌群023503《生活饮用水标准检验方法 第 12 部分: 微生物指标》GB/T5750.12-2023 6.1、6.2
Standard examination methods for drinking water—Part 12: Microbiological indices
55大肠埃希氏菌023503《生活饮用水标准检验方法 第 12 部分: 微生物指标》GB/T5750.12-2023 7.1
Standard examination methods for drinking water—Part 12: Microbiological indices
66贾第鞭毛虫孢囊023503《生活饮用水标准检验方法 第 12 部分: 微生物指标》GB/T5750.12-2023 8.1.4.4
Standard examination methods for drinking water—Part 12: Microbiological indices
77隐孢子虫卵囊023503《生活饮用水标准检验方法 第 12 部分: 微生物指标》GB/T5750.12-2023 8.1.4.4
Standard examination methods for drinking water—Part 12: Microbiological indices
共 7 项参数：7 项已自动推荐领域代码，0 项待人工确认。领域代码依据 CNAS-AL06:2024 规则推荐，检测对象依据：标准名称（方法标准主体）；正式申报前请人工核对，「说明」列的限制范围（只测/不测、量程等）按实验室实际填写。
解析模型与复核模型对以下关键数值意见不一。 点击您认可的一侧卡片即可投票，多数人的意见即最终结论；每项仅可投一次，首次投票 +2 LP。 已定案项目会在正文对应位置标注 ⚖，悬停可见两模型的分歧详情。
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